Thứ Tư, 6 tháng 6, 2018

Sử dụng năng lượng trong sinh tổng hợp ở vi sinh vật


Như trên dã nói vi sinh vật có thể thu nhận năng lượng qua nhiều con đường. Phần lớn năng lượng này được dùng cho sinh tổng hợp hoặc đồng hoá. Trong quá trình sinh tổng hợp vi sinh vật bắt đầu với các tiền chất đơn giản như các phân tử vô cơ và các monome và kiến trúc nên các phân tử ngày càng phức tạp hơn cho tới khi xuất hiện các bào quan và các tế bào mới (Hình 1). Mỗi tế bào vi sinh vật phải sản xuất ra nhiều loại phân tử khác nhau; tuy nhiên, trong chương này chỉ có thể giới thiệu việc tổng hợp những thành phần tế bào quan trọng nhất.



Kiến trúc của các tế bào. Sinh tổng hợp của các thành phần tế bào nhân nguyên thủy và nhân thật. Sinh tổng hợp được tổ chức ở các cấp độ ngày càng phức tạp hơn. (Theo Prescott và cs, 2005)
Vì đồng hoá là tạo ra một trật tự và mỗi tế bào được sắp xếp ở mức độ cao, cực kỳ phức tạp, do đó sinh tổng hợp đòi hỏi nhiều năng lượng. Điều này dễ nhận thấy khi ta xem xét năng lực sinh tổng hợp của tế bào E. coli đang sinh trưởng nhanh (bảng 1). Mặc dù hầu hết ATP dành cho sinh tổng hợp được dùng cho tổng hợp protein, nhưng ATP cũng được dùng cho tổng hợp các thành phần khác của tế bào.

Sinh tổng hợp ở E. coli. a/ Tính cho 1 tế bào có thể tích 2,25 μm3, trọng lượng 1x10-12g, trọng lượng khô 2,5x10-13g và chu trình phân bào là 20 phút. b/ Chú ý: vi khuẩn có thể chứa nhiều bản sao của ADN genom. (Theo: Prescott và cs)


Năng lượng tự do cần cho sinh tổng hợp trong các tế bào trưởng thành có kích thước ổn định vì các phân tử của tế bào liên tục bị phân giải và được tổng hợp lại trong một quá trình được gọi là vòng quay (turnover). Các tế bào không bao giờ chi nhau ở từng thời điểm khác nhau. Mặc dù vòng quay của các thành phần tế bào là liên tục nhưng trao đổi chất vẫn được điều hoà cẩn thận sao cho tốc độ sinh tổng hợp nói chung, được cân bằng với tốc tộ phân giải. Ngoài năng lượng dùng cho quay vòng các phân tử nhiều tế bào không sinh trưởng cũng sử dụng năng lượng để tổng hợp các enzyme và các chất khác giải phóng vào môi trường.

CÁC NGUYÊN TẮC ĐIỀU CHỈNH SINH TỔNG HỢP


Trao đổi chất trong sinh tổng hợp tuân theo một số nguyên tắc chung, 6 trong số các nguyên tắc này được tóm tắt dưới đây:

Mỗi tế bào vi sinh vật chứa một lượng lớn các protein, acid nucleic và polisaccaride. Tất cả đều là các cao phân tử tức là các polime gồm các đơn vị nhỏ hơn liên kết với nhau. Việc kiến trúc các phân tử lớn, phức tạp từ một vài đơn vị cấu trúc đơn giản hoặc monome tiết kiệm được nhiều dự trữ di truyền, nguyên liệu cho sinh tổng hợp và năng lượng. Ta hãy xem xét tổng hợp protein để hiểu rõ vấn đề này. Các protein, bất kể có kích thước, hình dạng hoặc chức năng như thế nào, đều được tạo thành chỉ bởi 20 amino acid thông thường nối với nhau nhờ liên kết peptide. Các protein khác nhau đơn giản chỉ là do có thứ tự amino acid khác nhau nhưng không phải là các amino acid mới và khác. Giả dụ, nếu các protein được tạo thành không phải bằng 20 mà bằng 40 amino acid khác nhau, tế bào sẽ phải cần các enzyme để sản xuất ra các amino acid nhiều gấp đôi (hoặc phải nhận được các acid bổ sung từ thức ăn). Các enzyme bổ sung đòi hỏi phải có các gen và tế bào lại phải đầu tư thêm nguyên liệu và năng lượng cho việc tổng hợp các gen, các enzyme và các amino acid bổ sung này. Rõ ràng, việc sử dụng một vài monome nối với nhau bởi một liên kết cộng hoá trị duy nhất khiến cho việc tổng hợp các cao phân tử trở thành một quá trình rất có hiệu quả. Hầu như tất cả các cấu trúc tế bào đều được kiến trúc chủ yếu bởi khoảng 30 tiền chất nhỏ.

Tế bào thường tiết kiệm các nguyên vật liệu và năng lượng bằng cách sử dụng các enzyme dùng cho cả dị hoá và đồng hoá. Chẳng hạn, hầu hết các enzyme đường phân đều tham gia tổng hợp và phân giải glucose se.

Mặc dù nhiều enzyme trong các con đường lưỡng hoá hoạt động trong cả phân giải và tổng hợp nhưng một số bước lại được xúc tác bởi hai enzyme khác nhau: một xúc tác phản ứng theo hướng phân giải và một theo hướng tổng hợp (Hình 2). Vì vậy, các con đường dị hoá và đồng hoá không bao giờ chi nhau mặc dù có nhiều enzyme chung. Việc sử dụng các enzyme riêng rẽ theo hai hướng ở một bước đơn độc cho phép điều chỉnh dị hoá và đồng hoá một cách độc lập. Cần nhớ rằng việc điều chỉnh đồng hoá hơi khác với điều chỉnh dị hoá. Cả hai con đường đều có thể điều chỉnh được bởi sản phẩm cuối cùng cũng như bởi nồng độ ATP, ADP, AMP và NAD+. Tuy nhiên, trong các con đường đồng hoá việc điều chỉnh bởi sản phẩm cuối cùng, nói chung, có vai trò quan trọng hơn.

Để tổng hợp các phân tử một cách hiệu quả các con đường đồng hoá phải hoạt động không thuận nghịch theo hướng sinh tổng hợp. Tế bào có thể thực hiện điều này bằng cách liên kết một số phản ứng sinh tổng hợp với sự phân giải ATP và các nucleoside triphosphate khác. Khi hai quá trình này được liên kết năng lượng tự do thoát ra trong sự phân giải nucleoside triphosphate sẽ hướng dẫn phản ứng sinh tổng hợp hoàn thành.

Ở các vi sinh vật nhân thật các con đường sinh tổng hợp thường diễn ra bên trong các khoang tế bào khác với các con đường phân giải tương ứng. Chẳng hạn, sinh tổng hợp acid béo gặp trong tế bào chất trong khi sự oxy hoá acid béo được thực hiện bên trong ti thể. Sự phân khoang tạo điều kiện cho các con đường hoạt động đồng thời không phụ thuộc vào nhau.

Cuối cùng, các con đường đồng hoá và dị hoá thường sử dụng các cofactor khác nhau. Các phản ứng oxy hoá trong phân giải, nói chung, sản ra NADH là một cơ chất cho vận chuyển electron. Trái lại, khi một chất cho electron là cần cho sinh tổng hợp thì NADPH chứ không phải NADH thường đảm nhiệm chức năng này. Trao đổi chất của acid béo cung cấp ví dụ thứ hai. Các phân tử acyl-CoA của acid béo bị oxy hoá để sản ra năng lượng trong khi tổng hợp acid béo có sự tham gia của các tioeste của protein mang nhánh acyl.

Một con đường sinh tổng hợp giả thuyết. Các con đường liên kết G với X, Y và Z hoàn toàn là đồng hóa vì chúng chỉ được dùng để tổng hợp các sản phẩm cuối cùng. Con đường từ A đến G là lưỡng hóa, nghĩa là có cả chức năng dị hóa và đồng hóa. Hầu hết các phản ứng được dùng trong cả 2 vai trò; tuy nhiên, sự chuyển hóa qua lại của C và D được xúc tác bởi 2 enzyme riêng biệt, E1 (dị hóa) và E2 (đồng hóa). (Nguồn Prescott và cs, 2005)

Sau khi các cao phân tử đã được kiến trúc từ các tiền chất đơn giản hơn chúng sẽ được tập hợp thành các cấu trúc lớn hơn, phức tạp hơn như các hệ thống siêu phân tử và các bào quan (Hình 1). Các cao phân tử thường chứa thông tin cần thiết để tạo thành một cách ngẫu nhiên trong một quá trình gọi là tự tập hợp. Chẳng hạn, riboxom là những tập hợp lớn gồm nhiều protein và các phân tử acid ribonucleic nhưng chúng được tạo thành nhờ sự tập hợp của các thành phần không cần có sự tham gia của các yếu tố bổ sung.

CỐ ĐỊNH QUANG HỢP CO2


Mặc dù hầu hết vi sinh vật có thể cố định CO2 ít nhất là trong các phản ứng bổ sung tuy nhiên chỉ các cơ thể tự dưỡng mới có khả năng sử dụng CO2 làm nguồn carbon duy nhất hoặc chủ yếu. Sự khử và cố định CO2 đòi hỏi nhiều năng lượng. Các cơ thể tự dưỡng thường thu năng lượng nhờ sự hấp thu ánh sáng trong quang hợp nhưng một số nhận được năng lượng từ phản ứng oxy hoá các chất cho electron vô cơ khử. Sự cố định CO2 tự dưỡng có ý nghĩa quyết định đối với sự sống trên trái đất vì nó cung cấp chất hữu cơ cho các cơ thể dị dưỡng.

Vi sinh vật có thể cố định CO2 hoặc chuyển phân tử vô cơ này thành carbon hữu cơ và đồng hoá nó theo ba con đường chủ yếu. Hầu như tất cả các vi sinh vật tự dưỡng đều cố định CO2 qua con đường trao đổi chất đặc biệt được gọi là chu trình Calvin (cũng gọi là chu trình Calvin-Benson hoặc chu trình pentose-phosphate khử). Mặc dù hoạt động trong các cơ thể quang hợp có nhân thật và hầu hết cơ thể quang hợp có nhân nguyên thuỷ nhưng chu trình Calvin lại vắng mặt ở Archaea (Cổ khuẩn), một số vi khuẩn kỵ khí bắt buộc và một số vi khuẩn hiếu khí. Những vi khuẩn này thường sử dụng một trong hai con đường khác. Một số archaea (Thermoproteus, Sulfolobus) và các vi khuẩn Chlorobium và Desulfobacter sử dụng con đường acid tricarboxylic khử. Ở các vi khuẩn sinh metan, vi khuẩn khử sulfate và các vi khuẩn sinh acetate (các vi khuẩn tạo thành acetate từ CO2 trong quá trình lên men) lại tồn tại con đường Acetyl-CoA.

Chu trình Calvin gặp trong chất nền (stroma) của lục lạp của các vi sinh vật nhân thật tự dưỡng. Vi khuẩn lam, một số vi khuẩn nitrate hoá và các thiobacilli chứa các thể vùi, đa diện gọi là cacboxysom. Cacboxysom chứa enzyme ribulo-1,5-bisphosphate carboxylase, có thể là vị trí cố định CO2 hoặc vị trí dự trữ carboxylase và các protein khác. Có thể chia chu trình Calvin thành 3 pha: carboxyl hoá, khử và tái sản. Sơ đồ chung của chu trình được giới thiệu ở hình 4.

Pha carboxyl hoá (carboxylation phase)

Sự cố định CO2 được xúc tác bởi enzyme ribulo-1,5-bisphosphate-carboxylase hoặc oxygenase (rubisco) (Hình 3) xúc tác việc gắn CO2 vào ribulo-1,5-bisphosphate (RuBP) tạo thành 2 phân tử 3-phosphorus-glycerat (PGA).


Phản ứng ribulo-1,5-bisphosphate carboxylase. Enzyme xúc tác bổ sung CO2vào ribulo-1,5-bisphosphate tạo thành 1 chất trung gian không bền, sau đó chất này bị phân giải thành 2 phân tử 3-phosphorusglycerat. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Pha khử (reduction phase)

Tiếp theo, PGA bị khử thành glyceraldehyde-3-phosphate. Sự khử được xúc tác bởi 2 enzyme, thực chất là sự đảo nghịch một phần của con đường đường phân mặc dù glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase khác với enzyme đường phân trong việc sử dụng NADP+ thay cho NAD+ (hình 4).

Pha tái sinh (regeneration phase)

Trong pha này RuBP được tái sản và sản ra các hidrat-carbon như glyceraldehyde-3-phosphate, fructose za và glucose (Hình 4). Phần này của chu trình chi với con đường pentose-phosphate và bao gồm các phản ứng của trans-ketolase và transaldolase. Chu trình được hoàn thành khi phosphorusribulokinase tái tạo RuBP.Để tổng hợp fructose -6-phosphate hoặc glucose -6-phosphate từ CO2 chu trình phải hoạt động 6 lần để sản ra hexose cần thiết và tái tạo 6 phân tử RuBP.

6RuBP + 6CO2 → 12PGA → 6RuBP + Fructose -6-P

Việc cố định một CO2 thành chất hữu cơ cần 3ATP và 2NADPH. Glucose được tạo thành từ CO2 theo phương trình sau:

6CO2 + 18ATP + 12NADPH + 12H+ + 12H2O → glucose + 18ADP + 18Pi + 12NADP+


Chu trình Calvin. Trên đây là sơ đồ vắn tắt của chu trình chỉ với các pha carboxyl hóa và khử được trình bày chi tiết. 3 ribulo-1,5-bisphosphate được carboxyl hóa tạo thành sáu 3-phosphorusglycerat trong pha carboxyl hóa. Các chất này được chuyển hóa thành 6 glycerat-3-phosphate rồi có thể thành dihydroxyacetone phosphate (DHAP) 5 trong số 6 triose (glyceraldehyde phosphate và dihydroxyacetone phosphate) được dùng để tạo lại 3 ribulo-1,5-bisphosphate trong pha tái sản. Triose còn lại được dùng trong sinh tổng hợp. Những con số trong ngoặc đơn ở bên phải phía dưới chỉ ra dòng carbon này. (Theo: Prescott và cs, 2005)

ATP và NADPH được cung cấp bởi các phản ứng sáng quang hợp hay bởi sự oxy hoá các phân tử vô cơ ở các vi khuẩn hoá tự dưỡng. Sau đó các đường tạo thành trong chu trình Calvin có thể được dùng để tổng hợp các phân tử cần thiết khác.

TỔNG HỢP CÁC ĐƯỜNG VÀ POLISACCHARIDE


Nhiều vi sinh vật không có khả năng quang hợp và là các cơ thể dị dưỡng phải tổng hợp đường từ các phân tử hữu cơ khử thay cho từ CO2.


Sự tái tạo đường. Con đường tái tạo đường găp ở nhiều vi sinh vật. Tên của 4 enzyme gặp trong đường phân được đóng khung. Các bước đường phân cũng được biểu thị để so sánh. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Việc tổng hợp glucose từ các tiền chất không phải hidrat carbon được gọi là sự tái tạo đường (glucose neogenesis). Mặc dù con đường tái tạo đường không chi con đường đường phân nhưng chúng có 7 enzyme chung (Hình 5).

Ba bước đường phân sau đây là không thuận nghịch trong tế bào: 1) Chuyển hoá phosphorusenolPyruvate thành pyruvate; 2) tạo thành fructose -1,6-bisphosphate từ fructose -6-phosphate và 3) phosphoryl hoá glucose. Các bước này phải đi vòng khi con đường hoạt động theo hướng sinh tổng hợp. Chẳng hạn, sự tạo thành fructose -1,6-bisphosphate bởi phosphorusfructose kinase được đảo nghịch bởi enzyme fructose -bisphosphatease, enzyme này loại bỏ nhờ thuỷ phân một phosphate từ fructose -bisphosphate. Thông thường ít nhất hai enzyme tham gia vào việc chuyển hoá pyruvate thành phosphorusenol pyruvate (đảo nghịch bước pyruvate kinase).

Từ hình 5 có thể thấy con đường tổng hợp fructose za tương tự như con đường tổng hợp glucose se. Một khi glucose và fructose za đã được tạo thành các đường phổ biến khác cũng được sản sinh. Chẳng hạn, mannose được hình thành trực tiếp từ fructose za qua một sự sắp xếp lại đơn giản:

Fructose -6-phosphate ↔ Mannose-6-phosphate

Một số đường được tổng hợp trong khi liên kết với một nucleoside diphosphate. Đường nucleoside diphosphate quan trọng nhất là uridine diphosphate glucose (UDPG). Glucose được hoạt hoá nhờ gắn với pyrophosphate của uridine diphosphate qua phản ứng với uridine triphosphate (Hình 6).


Uridine diphosphate glucose (Theo: Prescott và cs, 2005)

Phần UDP của HDPG được các enzyme nhận ra và mang glucose đi khắp tế bào dùng tham gia vào các phản ứng hệt như ADP mang phosphate ở dạng ATP. UDP-galactose được tổng hợp từ UDPG qua việc sắp xếp lại của một nhóm hydroxyl. Một enzyme khác xúc tác việc tổng hợp UDP - acid glucuronic qua việc oxy hoá UDPG (hình 7).


Uridine diphosphate galactose và tổng hợp glucuronate. Trên hình là việc tổng hợp UDP-galactose và UDP-acid glucuronic từ UDP-glucose se. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các đường nucleoside diphosphate cũng đóng vai trò chủ chốt trong việc tổng hợp các polisaccaride như tinh bột và glycogen. Cũng lại ở đây, sinh tổng hợp không đơn giản chỉ là sự đảo ngược trực tiếp của phân giải. Sự phân giải glycogen và tinh bột diễn ra qua sự thuỷ phân để tạo thành các đường tự do hay qua việc gắn thêm nhánh phosphate vào các polime này để sản ra glucose -1-phosphate. Các đường nucleoside diphosphate không tham gia vào quá trình trên. Trái lại trong việc tổng hợp glycogen và tinh bột ở vi khuẩn và tảo adenosine diphosphate glucose được tạo thành từ glucose -1-phosphate và sau đó chuyển glucose vào cuối chuỗi glycogen và chuỗi tinh bột:

ATP + Glucose -1-phosphate → ADP-glucose + PPi

(Glucose se)n + ADP-glucose → (Glucose se)n+1 + ADP

Các đường nucleoside diphosphate cũng tham gia vào việc tổng hợp các phân tử phức tạp như thành tế bào vi khuẩn.


SỰ ĐỒNG HÓA PHOSPHORUS, LƯU HUỲNH (SULFUR) VÀ NITƠ (NITROGEN) VÔ CƠ


Ngoài carbon và oxy vi sinh vật cũng cần một lượng phosphorus, sulfur và nitrogen cho sinh tổng hợp. Mỗi nguyên tố nói trên được đồng hoá hoặc được cố định thành các phân tử hữu cơ qua các con đường khác nhau.

Sự đồng hoá phosphorus

Phosphorus gặp trong các acid nucleic, protein, phospholipid, ATP và các coenzyme như NADP. Nguồn phosphorus phổ biến nhất là các este của phosphate vô cơ và phosphate hữu cơ. Phosphate vô cơ được cố định qua việc tạo thành ATP thông qua một trong ba con đường: 1) quang phosphoryl hoá; 2) phosphoryl hoá oxy hoá và 3) phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất.

Đường phân cung cấp một ví dụ của con đường thứ ba. Phosphate được gắn với glyceraldehyde-3-phosphate tạo thành 1,3-bisphosphorusglycerat, sau đó chất này được dùng để tổng hợp ATP.

Glyceraldehyde-3-phosphate + Pi + NAD+ → 1,3-bisphosphorusglycerat + NADH + H+

1,3-bisphosphorusglycerat + ADP → 3-phosphorusglycerat + ATP

Vi sinh vật có thể thu nhận các phosphate hữu cơ từ môi trường bao quanh ở dạng hoà tan hay dạng hạt. Các este của phosphate hữu cơ thường bị thuỷ phân bởi các phosphatease và tách ra phosphate vô cơ. Vi khuẩn gram âm chứa các phosphatease trong khoang chu chất nằm giữa thành tế bào và màng sinh chất;vì vậy sau khi được giải phóng phosphate được hấp thu trực tiếp qua màng. Động vật nguyên sinh, trái lại, có thể sử dụng trực tiếp các phosphate hữu cơ sau khi ăn hoặc thuỷ phân chúng trong lyzosom và tiêu thụ phosphate.

Sự đồng hoá sulfur

Sulfur cần cho việc tổng hợp amino acid (cystein và methionine) và một số coenzyme (coenzyme A, tiamine-pyrophosphate và biotin) và có thể thu được từ hai nguồn. Nhiều vi sinh vật sử dụng cystein và methionine dẫn xuất từ các nguồn bên ngoài hoặc từ dự trữ amino acid nội bào. Ngoài ra, sulfate có thể cung cấp sulfur cho sinh tổng hợp. Nguyên tử sulfur trong sulfate oxy hoá hơn nguyên tử sulfur trong cystein và các phân tử hữu cơ khác, do đó sulfate phải bị khử trước khi có thể được đồng hoá. Quá trình này được gọi là sự khử sulfate đồng hoá để phân biệt với sự khử sulfate dị hoá diễn ra khi sulfate tác dụng như chất nhận electron trong hô hấp kỵ khí.

Sự khử sulfate đồng hoá đòi hỏi phải hoạt hoá sulfate qua việc tạo thành phosphoadenosine-5’-phosphosulfate (Hình 8) tiếp theo là sự khử sulfate. Đây là một quá trình phức tạp (Hình 9) trong đó sulfate trước hết bị khử thành sulfit ( ***SORRY, THIS MEDIA TYPE IS NOT SUPPORTED.*** ) sau đó thành H2S. Cystein có thể được tổng hợp từ sulfua hydro qua hai con đường.


Phosphorusadenosin 5’-phosphorussulfate (PAPS). Theo: Prescott và cs, 2005)


Nấm có thể kết hợp H2S với serine tạo thành cystein nhưng nhiều vi khuẩn lại gắn H2S với O-Acetylserine (quá trình 1 và 2, lần lượt)



Một khi được tạo thành cystein có thể được dùng để tổng hợp các hợp chất hữu cơ khác có chứa sulfur.

Sự đồng hoá nitrogen

Do là thành phần chủ yếu của các protein, acid nucleic, coenzyme và nhiều thành phần khác nên năng lực đồng hoá nitrogen của tế bào là cực kỳ quan trọng. Mặc dù khí quyển giàu khí nitrogen nhưng chỉ một số ít vi khuẩn có thể khử khí này và sử dụng làm nguồn nitrogen. Còn hầu hết vi sinh vật có khả năng đồng hoá ammonia hoặc nitrate.

Sự đồng hoá ammonia

Nitrogen của ammonia có thể được chuyển hoá thành chất hữu cơ tương đối dễ dàng và trực tiếp vì nitrogen ở đây gặp trong trạng thái khử hơn các dạng khác của nitrogen vô cơ. Một số vi sinh vật tổng hợp amino acid alanine trong một phản ứng amine hoá khử xúc tác bởi alanine-dehydrogenase:

Pyruvate + NH4+ + NADH (NADPH) + H+ alanine ↔ + NAD+(NADP+) + H2O


Con đường đồng hóa ammonia. Sự đồng hóa ammonia nhờ glutamate.dehydrogenase (GDH) và transaminease. Các GDH phụ thuộc NADP hoặc NAD có thể tham gia vào đây. Con đường này hoạt động mạnh nhất ở những nồng độ ammonia cao (Theo Prescott và cs, 2005)

Con đường chủ yếu đồng hoá ammonia là tạo thành glutamate từ α-ketoglutarate (một chất trung gian của chu trình TCA). Nhiều vi khuẩn và nấm sử dụng glutamate-dehydrogenase khi nồng độ ammonia cao:

α -ketoglutarate + NH4++ NADPH (NADH) + H+ ↔ Glutamate + NADP+ (NAD+) + H2O

Việc sử dụng NADPH và NADH (tác nhân khử) trong tổng hợp glutamate thay đổi tuỳ theo loài.

Một khi alanine hoặc glutamate đã được tổng hợp nhóm α-amine mới được tạo thành có thể được chuyển sang các bộ khung carbon khác thông qua các phản ứng chuyển amine, từ đó sẽ xuất hiện các amino acid khác. Các transaminease chứa coenzyme pyridoxal phosphate có chức năng chuyển nhóm amine. Vi sinh vật có một số transaminease, mỗi enzyme này xúc tác việc tạo thành một số amino acid bằng cách sử dụng cùng một amino acid làm chất cho nhóm amine. Khi glutamate-dehydrogenase hoạt động phối hợp với các transaminease ammonia có thể được chuyển thành nhiều amino acid (hình 10).


Glutamine synthetase và glutamate synthase. Các phản ứng do 2 enzyme này xúc tác tham gia vào việc đồng hóa ammonia. Một số glutamate synthetase sử dụng NADPH là nguồn electron, số khác lại sử dụng ferredoxin khử (Fd). (Nguồn Prescott và cs, 2005)

Con đường thứ hai dùng đồng hoá ammonia bao gồm 2 enzyme tác dụng theo thứ tự, đó là glutamine synthetase và glutamate-synthase (hình 11). Ammonia được dùng để tổng hợp glutamine từ glutamate, sau đó nitrogen amit của glutamine được chuyển đến α-ketoglutarate để tạo thành một phân tử glutamate mới. Vì glutamate tác dụng như một chất cho amine trong các phản ứng của transaminease nên ammonia có thể được dùng để tổng hợp tất cả các amino acid thông thường khi có mặt các transaminease thích hợp (hình 12).

Cả ATP và một nguồn các electron như NADPH hay ferredoxin khử đều cần. Con đường này gặp ở E. coli, B. megaterium và nhiều vi khuẩn khác. Hai enzyme tác dụng theo thứ tự hoạt động rất hiệu quả ở các nồng độ ammonia thấp khác với con đường glutamate dehydrogenase. Như đã nói ở trên glutamine synthetase được điều hoà chặt chẽ nhờ sự cải biến cộng hoá trị thuận nghịch và các effector dị lập thể.


Cố định ammonia nhờ glutamine synthetase và glutamate synthase. Con đường này hoạt động có hiệu quả ở những nồng độ ammonia thấp. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Sự khử nitrate đồng hoá

Nitrogen trong nitrate ( ***SORRY, THIS MEDIA TYPE IS NOT SUPPORTED.*** ) ở trạng thái oxy hoá hơn nhiều so với nitrogen trong ammonia. Nitrate trước hết phải bị khử thành ammonia trước khi nitrogen có thể được chuyển hoá thành một dạng hữu cơ. Sự khử này của nitrate được gọi là khử nitrate đồng hoá. Quá trình này khác với quá trình diễn ra trong hô hấp kỵ khí và khử nitrate dị hoá. Trong sự khử nitrate đồng hoá nitrate được chuyển thành chất hữu cơ và không tham gia vào việc sản sinh năng lượng. Khử nitrate đồng hoá gặp phổ biến ở vi khuẩn, nấm và tảo.

Quá trình nói trên diễn ra trong tế bào chất ở vi khuẩn.

Bước thứ nhất trong đồng hoá nitrate là khử nitrate thành nitrite xúc tác bởi nitrate reductase là enzyme chứa FAD và molipden (Hình 13), NADPH là nguồn electron:

NO3+ + NADPH +H+ → NO2-+ NADP+ + H2O

Sau đó, nitrite bị khử thành ammonia thông qua một số lần bổ sung 2 electron được xúc tác bởi nitrite reductase và có thể cả các enzyme khác. Hydroxylamine có thể là một chất trung gian. Tiếp theo ammonia được chuyển hoá thành các amino acid nhờ các con đường đã mô tả.

Khử nitrate đồng hóa. Con đường này gặp ở các vi khuẩn có thể khử và đồng hóa nitrogen của nitrate. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Sự cố định Nitrogen (Nitrogen fixation)

Sự khử khí nitrogen của khí quyển được gọi là sự cố định nitrogen. Vì nồng độ của ammonia và nitrate thường thấp, hơn nữa chỉ một số vi khuẩn có khả năng trên (các tế bào nhân thật hoàn toàn không thể thực hiện được cố định N2) nên tốc độ của quá trình này trong nhiều hoàn cảnh, hạn chế sinh trưởng của thực vật. Cố định nitrogen gặp ở: 1) các vi khuẩn sống tự do (ví dụ: Azotobacter, Klebsiella, Clostridium và Methanococcus); 2) các vi khuẩn cộng sinh với thực vật như các cây họ Đậu (Rhizobium), cây phi lao (xạ khuẩn Frankia) và bèo dâu (vi khuẩn lam Anabaena azollae) và 3) các vi khuẩn lam (Nostoc và Anabaena).

Sự khử nitrogen thành ammonia được xúc tác bởi enzyme nitrogenase. Mặc dù các chất trung gian gắn vào enzyme ta còn chưa rõ nhưng có lẽ nitrogen bị khử qua một số lần bổ sung 2 electron như Hình 14 mô tả. Sự khử nitrogen phân tử thành ammonia phát nhiệt mạnh nhưng phản ứng có năng lượng hoạt hoá cao do nitrogen phân tử là một khí trơ với một liên kết ba giữa hai nguyên tử nitrogen.

Vì vậy, sự khử nitrogen là tốn kém và tiêu thụ nhiều ATP. Ít nhất 8 electron và 16ATP, cứ 4ATP là cần cho một cặp electron.

N2 + 8H+ + 8e + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi


Khử nitrogen. Giả thuyết khử nitrogen nhờ nitrogenase. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các electron bắt nguồn từ ferredoxin đã bị khử bởi một số con đường, chẳng hạn qua quang hợp ở vi khuẩn lam, qua các quá trình hô hấp ở các vi khuẩn cố định nitrogen hiếu khí hoặc qua lên men ở các vi khuẩn kỵ khí. Ví dụ, Clostridium pasteurianum (một vi khuẩn kỵ khí) khử ferredoxin trong quá trình oxy hoá Pyruvate, trong khi Azotobacter (một vi khuẩn hiếu khí) lại sử dụng electron từ NADPH để khử ferredoxin.

Nitrogenase là một phức hệ gồm 2 protein chủ yếu: một protein MoFe (hay nitrogenase, MW 220.000) liên kết với 1-2 protein Fe (hay nitrogenase reductase, MW 64.000). Protein MoFe chứa 2 nguyên tử molipden và 28-32 nguyên tử sắt; protein Fe chứa 4 nguyên tử sắt hình 15). Fe và Mo của protein MoFe được chứa bên trong một cofactor gọi là FeMo-co và sự khử N2 diễn ra ở cofactor này.

Trước hết protein Fe bị khử bởi ferredoxin sau đó nó liên kết ATP (hình 16). Sự liên kết ATP làm thay đổi hình thể của protein Fe và hạ thấp thế khử của protein này (từ 100mV đến ∼ 400 mV) tạo điều kiện cho protein Fe khử protein MoFe. ATP bị thuỷ phân khi diễn ra sự chuyền electron này. Cuối cùng, protein MoFe khử chuyền các electron tới nitrogen nguyên tử.


Cấu trúc của protein Fe ở nitrogenase (Theo: Prescott và cs, 2005)

Một số vi khuẩn chứa enzyme hidrogenase oxi hóa H2 thành H2O và liên kết phản ứng này với việc tạo thành ATP hay với việc khử ferredoxin (Fd) hoặc flavodoxin (Fld) rồi các chất này lại có thể chuyển electron cho protein Fe. Nitrogenase rất mẫn cảm với O2 và phải được bảo vệ sao cho khỏi bị bất hoạt bởi O2 bên trong tế bào. Ở nhiều vi khuẩn lam sự bảo vệ này được thực hiện nhờ một cấu trúc đặc biệt gọi là dị bào nang (heterocyst), có vách dày, chỉ chứa hệ quang I (dùng tổng hợp ATP nhưng không tạo thành O2). Nitrogenase cố định N2 bên trong dị bào nang và nhận được saccarose từ các tế bào lân cận sau đó truyền nitrogen cố định được cho các tế bào trên. Ở các vi khuẩn hiếu khí, cố định N2 như Azotobacter nitrogenase được bảo vệ nhờ: (1) Lớp vỏ nhày bao quanh tế bào cản trở sự khuếch tán của O2 vào tế bào; (2) Vận tốc hô hấp cao nhờ đó O2 bị loại bỏ nhanh; (3) Nitrogenase được kết hợp với một protein đặc biệt nhờ đó không bị bất hoạt bởi O2. Nốt rễ của các cây đậu thuộc họ Leguminosae tạo thành một protein màu đỏ gọi là leghemoglobin có khả năng liên kết O2 tự do đủ cho quá trình hô hấp tạo thành ATP nhưng không kìm hãm hoạt tính của nitrogenase của vi khuẩn Rhizobium.


Cơ chế tác dụng của nitrogenase. Quá trình di chuyển của 2 electron từ ferredoxin tới nitrogen được lặp lại 3 lần để khử N2 thành 2 phân tử ammonia. Cân bằng ở phía dưới bao gồm cả việc khử proton thành H2. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Đáng chú ý, ở đây có sự cộng sinh di truyền giữa hai cơ thể: cây tổng hợp phần protein còn vi khuẩn tổng hợp nhóm hem. Tổng hợp nitrogenase không những bị kìm hãm bởi O2 nhưng cũng bởi các hợp chất nitrogen vô cơ và hữu cơ. Khi thiếu nguồn năng luợng ADP được tích lũy lại và ức chế hoạt tính của enzyme. Điều này làm tăng cái giá của sự khử N2. Theo tính toán để cố định được 1 mg N Clostridium pasteurianum phải tiêu thụ 1g C hữu cơ trong glucose khi đó vi khuẩn hiếu khí Azotobacter chroococcum thậm chí cần tới 30g.

Trong điều kiện đất thiếu Mo một số vi khuẩn có thể tổng hợp 2 loại nitrogenase khác: chứa Va (vanadi) Fe hay chỉ chứa Fe. Các cofactor tương tự FeMo-co gặp trong cả 2 nitrogenase nói trên nghĩa là FeVa-co (trong nitrogenase vanadi) và 1 nhóm Fe-S (tương tự FeMo-co và FeVa-co) nhưng thiếu cả Mo và Va (trong nitrogenase sắt)

Sự khử nitrogen thành NH3 diễn ra qua ba bước, mỗi bước cần 2 electron (hình 14 và 16). Như vậy 6 electron sẽ được chuyển và cần tổng cộng 12ATP đối với một phân tử nitrogen bị khử. Tuy nhiên trên thực tế quá trình thường tiêu thụ ít nhất 8 electron và 16ATP vì nitrogenase cũng khử các proton thành H2. Hydro phản ứng với diamine (HN = NH) tạo thành nitrogen và hydro. Chu trình vô ích này sản ra một phần N2 ngay trong điều kiện thuận lợi khiến cho việc cố định nitrogen trở nên tốn kém hơn. Các vi khuẩn cố định nitrogen cộng sinh có thể tiêu thụ tới 20% ATP do cây chủ sản ra Nitrogenase có thể khử một số phân tử chứa liên kết ba (như Acetylen, xianit và azit)

HC  CH + 2H+ + 2e → H2C = CH2

Tốc độ khử Acetylen thành etilen được dùng để đánh giá hoạt tính nitrogenase.

Một khi nitrogen phân tử đã bị khử thành ammonia, ammonia có thể được chuyển thành các chất hữu cơ. Ở Rhizobium (vi khuẩn cố định nitrogen cộng sinh), có lẽ ammonia khuếch tán khỏi tế bào vi khuẩn và được đồng hoá bởi các tế bào của cây đậu bao quanh. Việc đồng hoá ammonia có lẽ chủ yếu là tổng hợp glutamine bởi hệ thống glutamine synthetase - glutamate synthase (Hình 11). Tuy nhiên, allantoin và acid allantoic (các dẫn xuất của Purine) cũng được tổng hợp và được dùng cho việc vận chuyển nitrogen tới các phân tử khác của cây.

TỔNG HỢP CÁC AMINO ACID


Vi sinh vật thay đổi về các nguồn nitrogen được sử dụng nhưng hầu hết có thể đồng hoá một vài loại nitrogen vô cơ nhờ các con đường đã mô tả. Việc tổng hợp amino acid cũng đòi hỏi sự kiến trúc nên các bộ khung carbon thích hợp và thông thường đây là một quá trình phức tạp bao gồm nhiều bước. Do nhu cầu bảo tồn nitrogen, carbon và năng lượng nên các con đường tổng hợp acid amine, nói chung, được điều hoà chặt chẽ bởi các cơ chế dị lập thể và cơ chế kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng.

E. coli, tảo và hầu hết thực vật có khả năng tổng hợp tất cả amino acid từ các tiền chất. Các sinh vật khác kể cả người không có khả năng tổng hợp một số amino acid không thay thế và phải thu được chúng trong thức ăn. Một số vi khuẩn lactic như Lactobacillus hoàn toàn không tổng hợp được một amino acid nào và phải thu nhận chúng nhờ phân giải protein trong môi trường.Trong mục này không thể trình bày chi tiết con đường sinh tổng hợp của từng amino acid mà chỉ giới thiệu khái quát về sinh tổng hợp amino acid.


Tổ chức của sự đồng hóa. Các sản phẩm sinh tổng hợp dẫn xuất từ các chất trung gian của con đường lưỡng hóa. Chú ý 2 phản ứng cố định CO2 bổ sung chủ yếu. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Hình 17 mô tả quan hệ của con đường sinh tổng hợp amino acid với các con đường lưỡng hoá. Bộ khung của amino acid bắt nguồn từ Acetyl-CoA và các chất trung gian của chu trình TCA, đường phân và con đường pentose-phosphate. Để cho hiệu quả và kinh tế nhất các tiền chất dùng cho sinh tổng hợp amino acid được cung cấp chỉ từ một vài con đường lưỡng hoá chủ yếu. Thứ tự dẫn đến các amino acid riêng rẽ phân nhánh từ các con đường trung tâm này. Alanine, aspartat và glutamate được được tổng hợp nhờ sự chuyển amine lần lượt, trực tiếp từ Pyruvate, Oxaloacetatee và α-ketoglutarate.



Con đường phân nhánh của tổng hợp amino acid. Các con đường dẫn tới methionine, threonine, izoleucine và lysine. Mặc dù 1 số mũi tên biểu thị 1 bước tuy nhiên hầu hết những sự chuyển hóa qua lại đều đòi hỏi sự tham gia của 1 số enzyme. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Hầu hết các con đường sinh tổng hợp đều phức tạp hơn và các chất trung gian quen thuộc thường được dùng trong sinh tổng hợp của các họ amino acid có liên quan nhằm mục đích tiết kiệm hơn. Chẳng hạn, lysine, threonine, izoleucine và methionine đều được tổng hợp từ oxaloacetatee từ một con đường đồng hoá phân nhánh (Hình 18). Con đường sinh tổng hợp các amino acid thơm phenylalanine, tyrosine và tryptophan cũng có chung nhiều chất trung gian (Hình 19).


Tổng hợp các amino acid thơm (phenylalanine, tyrosine, tryptophan). Chú ý: hầu hết các mũi tên đều biểu thị trên 1 phản ứng enzyme. (Theo: Prescott và cs, 2005)

CÁC PHẢN ỨNG BỔ SUNG


Khi xem xét hình 17 ta thấy các chất trung gian của chu trình TCA được dùng trong sinh tổng hợp các pyrimidine và nhiều acid amine. Trên thực tế, các chức năng sinh tổng hợp của chu trình này quan trọng đến mức hầu hết chu trình hoạt động kỵ khí để cung cấp các tiền chất sinh tổng hợp mặc dù NADH là không cần thiết cho việc vận chuyển electron và phosphoryl hoá trong sự vắng mặt của O2. Do đó chu trình TCA có vai trò đáng kể trong việc cung cấp carbon cho sinh tổng hợp và các chất trung gian của chu trình có thể bị cạn kiệt nếu tế bào không có biện pháp duy trì chúng. Tuy nhiên vi sinh vật có các phản ứng hoàn lại các chất trung gian của chu trình giúp cho chu trình TCA có thể hoạt động liên tục khi sinh tổng hợp đang diễn ra mạnh mẽ. Các phản ứng thay thế các chất trung gian của chu trình được gọi là các phản ứng bổ sung (anaplerotic reactions).

Hầu hết vi sinh vật có thể thay thế các chất trung gian của chu trình TCA bằng cố định CO2, trong đó CO2 được chuyển hoá thành carbon hữu cơ và được đồng hoá. Cần phân biệt là, các phản ứng bổ sung không đảm nhiệm cùng chức năng như con đường cố định CO2 cung cấp carbon cần thiết ở các cơ thể tự dưỡng. Cố định CO2 ở các cơ thể tự dưỡng cung cấp hầu hết hoặc toàn bộ carbon cần cho sinh trưởng. Các phản ứng bổ sung cố định CO2 chỉ nhằm thay thế các chất trung gian và duy trì cân bằng trao đổi chất. Thường thường CO2 được gắn vào một phân tử chất nhận (Pyruvate hoặc phosphorusenolPyruvate) để tạo thành chất trung gian của chu trình là Oxaloacetatee (Hinh 17). Arthrobacter globiformis và nấm men sử dụng Pyruvate-carboxylase xúc tác phản ứng này.

Pyruvate  + CO2  + ATP  + H2  O  → Biotin Oxaloacetatee  + ADP  + Pi  

Enzyme trên cần cofactor là biotin và sử dụng năng lượng của ATP để liên kết CO2 vào Pyruvate. Biotin thường là cofactor của các enzyme xúc tác phản ứng carboxyl hoá. Do có chức năng quan trọng như vậy nên biotin là yếu tố sinh trưởng cần thiết đối với nhiều loài vi sinh vật. Các vi sinh vật khác như E. coli, Salmonella typhimurium lại sử dụng enzyme phosphoenolpyruvate-carboxylase xúc tác phản ứng dưới đây:

Phosphoenolpyruvate + CO2 → Oxaloacetatee + Pi

Một số vi khuẩn, tảo, nấm và động vật nguyên sinh có thể sinh trưởng với nguồn carbon duy nhất là acetate bằng cách sử dụng acetate để tổng hợp các chất trung gian của chu trình TCA trong chu trình glioxylat (Hình 20). Chu trình được thực hiện nhờ hai enzyme đặc biệt - Izocitrate liase và malat synthase - xúc tác các phản ứng sau:

Izocitrate  →izoxitrat   lyaza Succinat  + Glioxylat  

Glioxylat  + Acetyl  − CoA  →malat  sin  taza Malat  + CoA  

Chu trình glioxylat, thực ra là một chu trình TCA cải biến. Hai phản ứng loại carboxyl của chu trình TCA (bước Izocitrate dehydrogenase và α-ketoglutarate dehydrogenase) được bỏ qua giúp cho việc chuyển hoá Acetyl-CoA để tạo thành Oxaloacetatee mà không để mất carbon của Acetyl-CoA như CO2. Theo cách này, acetate và bất kỳ các phân tử nào được chuyển hoá thành acetate đều có thể đóng góp carbon vào chu trình và giúp cho sinh trưởng của vi sinh vật.

Chu trình glioxylat. Chú ý: các enzyme của chu trình TCA ở phần dưới được bỏ qua. (Theo: Prescott và cs, 2005)


TỔNG HỢP CÁC PURINE, PYRIMIDIN VÀ NUCLEOTIDE


Sinh tổng hợp của purine và pyrimidine là sống còn cho mọi tế bào vì các phân tử này được dùng để tổng hợp ATP, một số cofactor, acid ribonucleic (ARN), acid deoxyribonucleic (ADN) và các thành phần quan trọng khác của tế bào. Hầu hết vi sinh vật có thể tổng hợp các Purine và pyrimidine cho bản thân vì các chất này có vai trò quyết định đối với chức năng của tế bào.

Purine và pyrimidine là các bazơ nitrogen vòng chứa một số nối đôi và có các đặc tính thơm rõ rệt. Purine gồm 2 vòng nối với nhau, còn pyrimidine chỉ có một vòng (hình 21 và 23). Trong vi sinh vật thường gặp các purine adenin và guanin và các pyrimidine uracyl, xitozin và thymine. Một base purine hoặc pyrimidine nối với một đường pentose (ribose hoặc deoxyribose) là một nucleoside. Một nucleotide là một nucleoside nối với một hoặc trên một nhóm phosphate liên kết với đường.



Sinh tổng hợp Purine. Chú ý sự chỉ dẫn các nguồn N và C của bộ khung Purine. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Sinh tổng hợp Purine

Con đường sinh tổng hợp các purine là một thứ tự phức tạp gồm 11 bước trong đó 7 phân tử khác nhau góp phần vào bộ khung purine cuối cùng (Hình 21). Vì con đường mở đầu với ribo-5-phosphate và bộ khung purine được kiến trúc trên đường này nên sản phẩm purine đầu tiên của con đường là nucleotide acid inosinic chứ không phải là một base purine tự do. Trong sinh tổng hợp của purine cofactor acid folic đóng vai trò rất quan trọng. Các dẫn xuất của acid folic đóng góp carbon 2 và 8 vào bộ khung purine. Trên thực tế, thuốc sulfonamide kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn là do ức chế tổng hợp acid folic. Điều này sẽ ảnh hưởng đến sinh tổng hợp của purine và các quá trình khác cần acid folic.

Một khi acid inosinic đã được tạo thành, các con đường tương đối ngắn sẽ tổng hợp adenosine monophosphate và guanosine monophosphate (Hình 22) và sản ra nucleoside diphosphate và triphosphate bằng cách chuyển phosphate từ ATP. ADN chứa deoxyribonucleotide (ribose thiếu một nhóm hydroxyl trên C2) thay cho ribonucleotide gặp trong ARN. Các deoxyribonucleotide xuất hiện từ sự khử của các nucleoside diphosphate hoặc nucleoside triphosphate qua hai con đường khác nhau. Một số vi sinh vật khử triphosphate nhờ hệ thống cần cofactor vitamine B12. Số khác, như E. coli, lại khử ribose trong nucleoside diphosphate. Cả hai hệ thống đều sử dụng một protein nhỏ chứa S gọi là thioredoxin làm tác nhân khử.


Sinh tổng hợp adenosine monophosoahte và Guanosine Monophosphatee

Sinh tổng hợp pyrimidine

Sinh tổng hợp pyrimidine mở đầu với acid aspartic và cacbamoyl-phosphate (một phân tử cao năng được tổng hợp từ CO2 và ammonia) (Hình 23).

Aspartate-cacbamoyltransferase xúc tác việc ngưng tụ hai cơ chất này để tạo thành cacbamoyl-aspartat, sau đó chất này được chuyển thành sản phẩm pyrimidine đầu tiên đó là acid orotic.

Sau khi bộ khung pyrimidine được tổng hợp, một nucleotide sẽ được tạo thành bằng cách thêm vào ribo-5-phosphate nhờ tác dụng của chất trung gian cao năng 5-phosphorusribosyl-1-pyrophosphate. Do đó việc kiến trúc vòng pyrimidine được hoàn thành trước khi ribose được thêm vào trái với việc tổng hợp vòng Purine bắt đầu với ribo-5-phosphate. Việc loại carboxyl hoá của orotidine monophosphate sản ra uridine monophosphate và cuối cùng uridine triphosphate và cytidine triphosphate.

Tổng hợp pyrimidine. PRPP là acid 5-phosphorusribose 1- pyrophosphorusric, chất cung cấp chuỗi ribo-5-phosphate. Phần dẫn xuất từ cacbamoylphosphate được in đậm. (Theo: Prescott và cs, 2005)
Pyrimidine thứ ba phổ biến là thymine - một thành phần của ADN. Ribose trong các nucleotide pyrimidine bị khử theo cùng cách như trong các nucleotide purine. Sau đó deoxyuridine monophosphate được methyl hoá với dẫn xuất của acid folic để tạo thành deoxythymidine monophosphate (Hình 24).


Tổng hợp deoxythymidine monophosphate. Chú ý: deoxythymidine khác với deoxyuridine ở chỗ có thêm nhóm methyl. (Theo: Prescott và cs, 2005)


TỔNG HỢP LIPID


Vi sinh vật chứa nhiều lipid đặc biệt là ở màng tế bào. Lipid thường chứa các acid béo hoặc dẫn xuất của acid béo. Acid béo là các acid monocarboxylic với các chuỗi alkyl dài thường có một số chẵn carbon (chiều dài trung bình là 18 carbon). Một số có thể là chưa bão hoà nghĩa là có một hoặc trên một nối đôi. Hầu hết acid béo của vi sinh vật là chuỗi thẳng nhưng có một số phân nhánh. Các vi khuẩn gram âm thường có các acid béo cyclopropan (tức là các acid béo chứa một hoặc trên một các vòng cyclopropan trong chuỗi).

Việc tổng hợp các acid béo được xúc tác bởi phức hệ synthetase acid béo với Acetyl-CoA và malonyl-CoA như cơ chất và NADPH như chất cho electron. Malonyl-CoA dẫn xuất từ sự carboxyl hoá của Acetyl-CoA với sự tiêu thụ ATP. Việc tổng hợp diễn ra sau khi acetate và malonat đã được chuyển từ CoA đến nhóm sulfihidril của protein mang acyl (ACP, acyl carrier) là một protein nhỏ mang chuỗi acid béo đang sinh trưởng trong tổng hợp. Ở mỗi thời điểm synthetase lại thêm 2 carbon vào đầu carboxyl của chuỗi acid béo đang sinh trưởng trong một quá trình gồm hai chặng (Hình 25). Trước hết, malonyl-ACP phản ứng với acyl-ACP acid béo để sản ra CO2 và một acyl-ACP acid béo có 2 carbon dài hơn. Việc mất đi CO2 hướng cho phản ứng hoàn thành. Ở đây ATP được dùng để bổ sung CO2 vào Acetyl-CoA tạo thành malonyl-CoA. Cũng CO2 như vậy mất đi khi malonyl-ACP chuyền các carbon cho chuỗi. Do đó CO2 là cần thiết cho tổng hợp acid béo nhưng không phải luôn luôn được cố định. Trên thực tế, một số vi sinh vật cần CO2 để sinh trưởng tốt nhưng chúng vẫn có thể sinh trưởng thuận lợi khi không có CO2 mà có mặt một acid béo như acid oleic (một acid béo 18 carbon không bão hoà). Trong chặng thứ hai của tổng hợp nhóm α-keto xuất hiện từ phản ứng ngưng tụ ban đầu bị loại đi trong một quá trình ba bước bao gồm hai sự khử và một sự loại nước. Sau đó acid béo sẵn sàng cho việc bổ sung thêm 2 nguyên tử carbon nữa.


Tổng hợp acid béo. Chu trình được lặp lại cho tới khi chiều dài chuỗi thực sự đã đạt được. ACP = acyl carrier protein (protein mang acyl). (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các acid béo không bão hoà được tổng hợp theo hai con đường. Các tế bào nhân thật và vi khuẩn hiếu khí như Bacillus megaterium sử dụng con đường hiếu khí với sự tham gia của cả NADPH và O2.

Một nối đôi tạo thành giữa các carbon 9 và 10 và O2 bị khử thành nước nhờ các electron do cả acid béo và NADPH cung cấp. Các vi khuẩn kỵ khí và một số vi khuẩn hiếu khí tạo ra các nối đôi trong quá trình tổng hợp acid béo bằng cách loại nước các acid béo hydroxy. Oxy không cần cho việc tổng hợp nối đôi theo cách này. Con đường kỵ khí hoạt động ở một số vi khuẩn gram âm quen thuộc (ví dụ: E. coli và Salmonella typhimurium), vi khuẩn gram dương (ví dụ: Lactobacillus plantarum và Clostridium pasteurianum) và vi khuẩn lam.


Tổng hợp triacylglycerol và phospholipid. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các vi sinh vật nhân thật thường dự trữ carbon và năng lượng ở dạng triacylglycerol, glycerol được este hoá với 3 acid béo. Glycerol xuất hiện từ sự khử dihydroxyacetone phosphate (là chất trung gian của đường phân) thành glycerol-3-phosphate, sau đó glycerol-3-phosphate được este hoá với 2 acid béo để cho acid phosphateidic (Hình 26). Phosphate bị thuỷ phân khỏi acid phosphateidic tạo thành diacylglycerol và acid béo thứ ba được gắn vào để sản ra một triacylglycerol.

Phospholipid là thành phần chủ yếu của màng tế bào nhân thật và hầu hết tế bào nhân nguyên thuỷ. Tổng hợp phospholipid cũng thường diễn ra theo con đường của acid phosphateidic. Một chất mang đặc biệt-cytidine diphosphate (XDP)-đóng vai trò tương tự vai trò của các chất mang của uridine và adenosine diphosphate trong sinh tổng hợp hidrat carbon. Chẳng hạn, vi khuẩn tổng hợp phosphateidinetanolamine (một thành phần chủ yếu của màng tế bào) qua việc tạo thành XDP - diacylglycerol đầu tiên (Hình 26). Sau đó dẫn xuất XDP này phản ứng với serine để tạo thành phospholipid phosphateidilserine và qua việc loại carboxyl sẽ xuất hiện phosphateidinetanolamine. Theo cách này, một lipid màng, phức tạp được tạo nên từ các sản phẩm của đường phân, sinh tổng hợp acid béo và sinh tổng hợp acid amine.

TỔNG HỢP PEPTIDOGLYCAN


Hầu hết thành tế bào vi khuẩn chứa một phân tử lớn, phức tạp bao gồm các chuỗi polisaccaride dài tạo thành bởi các nhánh luân phiên acid N-Acetylmuramic (NAM) và N-Acetylglucose semin (NAG). Gắn vào các nhánh NAM là các chuỗi pentapeptide. Các chuỗi polisaccaride được liên kết với nhau bởi các pentapeptide hay bởi các cầu nối gian - peptide phức tạp của peptidoglycan, dĩ nhiên, càng đòi hỏi một quá trình sinh tổng hợp phức tạp, đặc biệt còn vì các phản ứng tổng hợp diễn ra ở cả bên trong và bên ngoài màng tế bào. Tổng hợp peptidoglycan là một quá trình nhiều bước và đã được nghiên cứu chi tiết ở vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus. Ở đây có sự tham gia của hai chất mang là uridine diphosphate (UDP) và bactoprenol (Hình 27). Bactoprenol là một alcohol 55 carbon gắn vào NAM bởi một nhóm pyrophosphate và vận chuyển các thành phần của peptidoglycan qua màng kỵ nước.



Bactoprenol pyrophosphate. Chú ý: Chất này được gắn vào NAM. (Theo: Prescott và cs, 2005)
Tổng hợp peptidoglycan (Hình 28 và 29) diễn ra qua 8 bước:

Các dẫn xuất UDP của acid N.Acetylmuramic và N-Acetylglucosamine được tổng hợp trong tế bào chất.

Các amino acid lần lượt được thêm vào UDP-NAM tạo thành chuỗi pentapeptide (2 D-alanine tận cùng được thêm vào ở dạng dipeptide). Năng lượng của ATP được dùng để sản ra các liên kết peptide nhưng không có sự tham gia của tRNA và riboxom.
Xem hình 28.
NAM-pentapeptide được chuyển từ UDP sang phosphate của bactoprenol ở bề mặt của màng.
UDP-NAG bổ sung NAG vào NAM-pentapeptide tạo thành đơn vị lặp lại của peptidoglycan. Nếu một cầu nối pentaglycine là cần thiết các glycine sẽ được thêm vào bằng cách sử dụng các phân tử glycyl-tRNA đặc biệt nhưng không cần riboxom.
Sau khi đã hoàn thành đơn vị lặp lại của peptidoglycan NAM-NAG được chuyển qua màng đến bề mặt bên ngoài nhờ chất mang bactoprenol pyrophosphate. Đơn vị peptidoglycan được gắn vào đầu đang sinh trưởng của một chuỗi peptidoglycan kéo dài chuỗi một đơn vị lặp lại.
Chất mang bactoprenol trở lại bên trong màng. Trong quá trình này một phosphate được tách ra để cho bactoprenol phosphate giờ lại có thể nhận một NAM-pentapeptide khác.
Cuối cùng, các liên kết peptide chéo giữa các chuỗi peptidoglycan được tạo thành nhờ phản ứng chuyển peptide (Hình 29). Ở E. coli nhóm amineo tự do của acid diamineopimelic liên kết với D-alanine gần tận cùng tách ra nhánh D-alanine tận cùng. ATP được dùng để tạo thành liên kết peptide tận cùng bên trong màng. Khi sự chuyển peptide diễn ra bên ngoài năng lượng của ATP là không cần nữa. Quá trình như vậy cũng được thực hiện khi có sự tham gia của một cầu nối; chỉ nhóm phản ứng với D-alanine gần tận cùng là khác.



Tổng hợp peptidoglycan. Chú ý: pentapeptide chứa L-lysine ở peptidoglycan của S. aureus và acid diamineopimelic (DAP) ở peptidoglycan của E. coli. Tác dụng kìm hãm của bacidraxin, xicloserine và vancomixin được chỉ rõ. Các con số tương ứng với 6 trong 8 bước nói trong bài. Bước 8 được mô tả ở hình 29. (Theo: Prescott và cs, 2005)


Chuyển peptide. Các phản ứng chuyển peptide trong việc tạo thành peptidoglycan ở E. coli và S. aureus. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Tổng hợp peptidoglycan rất mẫn cảm với các tác nhân kháng khuẩn. Sự kìm hãm bất kỳ bước nào trong tổng hợp đều làm cho thành tế bào bị yếu đi và có thể dẫn đến phá vỡ tế bào do thẩm thấu. Nhiều chất kháng sinh ảnh hưởng đến tổng hợp peptidoglycan. Chẳng hạn, penixilin kìm hãm phản ứng chuyển peptide (Hình 29) và bacitraxin ức chế việc loại phosphate khỏi bactoprenol pyrophosphate.


CÁC KIỂU TỔNG HỢP THÀNH TẾ BÀO


Để sinh trưởng và phân chia được thuận lợi tế bào vi khuẩn phải bổ sung peptidoglycan mới vào thành tế bào của mình một cách chính xác và có điều hoà cẩn thận trong khi vẫn duy trì được hình dạng và tính nguyên vẹn của thành nếu phải tồn tại ở điều kiện áp suất thẩm thấu cao. Vì peptidoglycan của thành là một mạng lưới khổng lồ duy nhất nên vi khuẩn đang sinh trưởng phải có khả năng phân giải lưới sao cho đủ để cung cấp các đầu nhận dùng lắp vào các đơn vị peptidoglycan mới. Sự phân giải peptidoglycan hạn chế này được xúc tác bởi enzyme gọi là autolyzin, trong đó một số autolyzin tác dụng lên các chuỗi polisaccaride, số khác thuỷ phân các liên kết chéo peptide. Các chất kìm hãm autolyzin điều hoà chặt chẽ hoạt tính của các enzyme này.

Mặc dù vị trí và sự phân bố của hoạt tính tổng hợp thành tế bào thay đổi tuỳ theo loài nhưng có lẽ tồn tại hai kiểu phổ biến (Hình 30) sau đây.


Các kiểu tổng hợp thành. Trong hình là các kiểu tổng hợp thành tế bào ở các vi khuẩn đang sinh trưởng và phân chia (a) Các streptococci và một số cocci khác gram dương. (b) Tổng hợp ở các vi khuẩn hình que (E. coli, Salmonella, Bacillus). (Theo: Prescott và cs, 2005)

Nhiều cầu khuẩn Gram dương (Enterococcus faecalis và Streptococcus) chỉ có một tới một vài vùng sinh trưởng. Vùng sinh trưởng chính thường ở vị trí tạo thành vách ngang và các nửa tế bào mới được tổng hợp giáp lưng nhau. Kiểu tổng hợp thứ hai gặp ở các trực khuẩn E. coli, Salmonella và Bacillus. Tổng hợp peptidoglycan mạnh mẽ diễn ra ở vị trí tạo thành vách ngăn ngang như trên nhưng các vị trí sinh trưởng cũng nằm rải rác dọc theo phần hình trụ của trực khuẩn. Do đó sinh trưởng được phân bố ở trực khuẩn tràn lan hơn ở cầu khuẩn. Việc tổng hợp phải kéo dài các tế bào hình que cũng như phân cắt chúng. Có lẽ điều này giải thích cho những sự khác nhau trong kiểu sinh trưởng của thành.

Nguồn: voer.edu.vn

Thứ Hai, 4 tháng 6, 2018

Vi khuẩn nhân tạo đầu tiên chỉ có 500 gen



Vi khuẩn nhân tạo đầu tiên. Ảnh: MARK ELLISMAN

Khi bàn tới kích cỡ bộ gen thì một loài hoa hiếm ở Nhật có tên Paris japonica đang giữ ngôi vô địch với ADN gấp 50 lần của con người. Ở chiều ngược lại của kích cỡ, một kỷ lục mới về sinh vật có bộ gen nhỏ nhất đang được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm tại California. Nhóm nghiên cứu dẫn đầu bởi Craig Venter đã công bố một loài vi khuẩn nhân tạo có bộ gen nhỏ nhất – và cũng ít gen nhất – so với bất kỳ sinh vật sống nào khác, nhỏ hơn 282.000 lần so với loài hoa ở Nhật. Được đặt tên là Syn 3.0, sinh vật mới này có bộ gen được cắt bớt cho đến khi chỉ còn những gen trọng yếu cần thiết để sống sót và sinh sản, chỉ có 473 gen.

Cấu trúc gen được sắp xếp của vi khuẩn này tạo sự phấn khích cho các nhà sinh học tiến hóa và công nghệ sinh học, những người dự đoán việc thêm vào từng gen để nghiên cứu tác dụng của chúng. “Đây là một bước quan trọng để tạo nên một tế bào sống với bộ gen được hiểu rõ hoàn toàn,” Chris Voigt chia sẻ, ông hiện là nhà sinh học tổng hợp tại MIT, Cambridge. Tuy nhiên Voigt và những người khác lưu ý rằng công trình này vẫn còn mặt hạn chế, bởi vì chức năng của 149 gen trên Syn 3.0 – khoảng một phần ba – vẫn còn là bí ẩn. Cần phải nghiên cứu vai trò của những gen đó, vì nó hứa hẹn mở ra tầm nhìn mới về sinh học cơ bản của cuộc sống.


Giáo sư Craig Venter. Ảnh: jcvi.org

Đây là phiên bản thứ 3 mà Venter tạo ra, trước đó vào năm 2010 nhóm của Venter cho biết họ đã tổng hợp được nhiễm sắc thể duy nhất của Mycoplasma mycoides – một loại vi khuẩn có bộ gen khá nhỏ – và cấy nó vào một vi khuẩn mycoplasma khác có tên M. capricolum, cũng là vi khuẩn mà họ đã trích xuất ADN. Sau vài khởi đầu thất bại, vi khuẩn nhân tạo cuối cùng đã khởi động và tổng hợp ra các protein thông thường được tạo bởi M. mycoides chứ không phải M. capricolum (Science, 21 May 2010, p. 958). Sau đó, thay vì thêm vào một ít ADN chỉ dẫn, nhóm nghiên cứu đã để vật liệu di truyển bên trong sinh vật nhân tạo ban đầu, có tên là Syn 1.0, không thay đổi từ cha mẹ chúng.

Ở công trình hiện tại, Venter cùng với trưởng dự án Clyde Hutchinson tại JCVI, bắt đầu xác định tập hợp các gen tối thiểu cần thiết cho sự sống bằng cách loại bỏ những gen không cần thiết từ Syn 1.0. Ban đầu họ thành lập 2 nhóm, mỗi nhóm có cùng nhiệm vụ: sử dụng tất cả kiến thức di truyền để thiết kế một nhiễm sắc thể của vi khuẩn với bộ gen giả thiết nhỏ nhất. Sau đó cả hai sẽ được tổng hợp và cấy vào M. capricolum để xem phương án nào tạo ra được một sinh vật sống.

“Tin giờ chót là chúng tôi đã thất bại. Thật ngạc nhiên,” Venter chia sẻ. Cả hai nhiễm sắc thể đều không tạo thành một vi khuẩn sống. Thật rõ ràng, kiến thức sinh học hiện nay của chúng tôi là không đủ để ngồi xuống và thiết kế nên một sinh vật sống rồi tạo ra nó.”

Venter và cộng sự đã thu được kết quả tốt hơn với phương pháp thử sai. Họ chia bộ gen của Syn 1.0, bao gồm 901 gen, thành 8 phần. Tại điểm bắt đầu và kết thúc của mỗi vùng, họ thêm vào các thẻ ADN giống hệt nhau để có thể dễ dàng ghép các phần lại với nhau. Điều này cho phép họ xem từng phần như các module độc lập, loại bỏ từng phần một, xóa những đoạn ADN, sau đó gắn lại thành bộ gen hoàn chỉnh rồi chèn lại vào M. capricolum để xem nó có thể tạo ra tế bào sống hay không. Nếu bộ gen chỉnh sửa không hoạt động, họ biết được là họ đã cắt bỏ một gen quan trọng và cần phải phục hồi. Nhóm nghiên cứu cũng đã đánh giá sự cần thiết của nhiều gen khác bẳng cách chèn vào vật liệu di truyền ngoại lai, được gọi là transposons, để gián đoạn hoạt động của chúng.


Chân dung sinh vật có bộ gen nhỏ nhất thế giới, chỉ 473 gen. Ảnh: MARK ELLISMAN/NATIONAL CENTER FOR IMAGING AND MICROSCOPY RESEARCH

Tất cả điều này đã giúp họ một cách hệ thống loại dần những gen không mang chức năng quan trọng hoặc lặp lại chức năng của một gen khác. Cuối cùng, nhóm của Venter đã xây dựng, thiết kế và thử nghiệm “hàng trăm” lần trước khi đạt đến Syn 3.0, với bộ gen chỉ bằng phân nửa Syn 1.0 (Syn 2.0 là bước đệm của quá trình này, vi khuẩn đầu tiên có bộ gen nhỏ hơn M. genitalium, với 525 gen, nhỏ hơn bất kỳ sinh vật sống nào.)

Khi quá trình loại bỏ kết thúc, các gen còn lại sẽ được sắp xếp theo trật tự thông thường. Quá trình tinh giản bộ gen cũng tương tự như máy tính sắp xếp và nén các file để dọn dẹp ổ cứng. Việc này có thể giúp các thí nghiệm tiếp tục trên Syn 3.0 dễ dàng hơn nhiều trong tương lai, Voigt cho biết.

Với tổng cộng 531.000 base, bộ gen của sinh vật mới không nhỏ hơn nhiều so với M. genitalium, có 600.000 base. Nhưng M. genitalium có tốc độ sinh trưởng khá chậm, phải mất hàng tuần để tế bào nhân đôi. Ngược lại, Syn 3.0 chỉ mất 3 giờ để phân bào, cho thấy nó phát triển nhanh với bộ gen tinh giản. “Chúng tôi không cho rằng đây là bộ gen nhỏ nhất sau cùng,” Venter chia sẻ. Tuy nhiên, cho đến hiện tại, Syn 3.0 là nhà vô địch mới về kích thước nhỏ.

Bibliography

Science. (2016, March 24). Synthetic microbe lives with fewer than 500 genes. Retrieved March 29, 2016 from http://www.sciencemag.org/news/2016/03/synthetic-microbe-lives-less-500-genes

<Dương Thụ dịch>

Chủ Nhật, 3 tháng 6, 2018

Các phương pháp cơ bản trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh

   

1. NHỮNG KIẾN THỨC CƠ BẢN VỂ VI KHUẨN


      1.1. Khái niệm vi khuẩn

          Vi sinh vật (micro-organism) bao gồm vi khuẩn và virus, nhưng vi khuẩn có đầy đủ đặc điểm của một vi sinh vật như khả năng tự tổng hợp chất dinh dưỡng để phát triển và nhân lên. Trên thực tế, vi khuẩn là những đơn bào không có màng nhân, thuộc giới procaryote, có thể quan sát được bằng kính hiển vi.

      1.2. Hình thể, kích thước và cấu trúc vi khuẩn

          Vi khuẩn là những sinh vật đơn bào, chúng có cấu trúc và hoạt động đơn giản hơn nhiều so với các tế bào có màng nhân (eucaryote). Tuy nhiên có một vài cơ quan như vách tế bào hay chức năng di truyền và sự vận chuyển di truyền phức tạp không kém sinh vật phát triển.

       1.2.1. Hình thể và kích thước vi khuẩn

          Mỗi loại vi khuẩn có hình dạng và kích thước nhất định, do vách của tế bào vi khuẩn quyết định. Hình thể và kích thước của vi khuẩn có thể quan sát và xác định được bằng phương pháp nhuộm và quan sát bằng kính hiển vi. Để xác định vi khuẩn, hình thể là một tiêu chuẩn rất quan trọng đóng vai trò định hướng, để định loại một vi khuẩn còn phải kết hợp với với các yếu tố khác như tính chất sinh vật hoá học, kháng nguyên của vi khuẩn và khả năng gây bệnh). Tuy nhiên trong một số trường hợp nhất định, dựa vào hình thể vi khuẩn kết hợp với lâm sàng người ta có thể chẩn đoán xác định bệnh.

          Đơn vị đo kích thước của vi khuẩn là micromet (1 µm = 1/1000 mm). Kích thước và hình thể của các loại vi khuẩn khác nhau thì không giống nhau và có thể còn phụ thuộc vào điều kiện tồn tại của chúng. Dựa vào hình thể, vi khuẩn được chia ra làm 3 loại lớn.

      1.2.1.1. Các cầu khuẩn:

          Cầu khuẩn là những vi khuẩn có hình cầu, nhưng cũng có thể là hình bầu dục hoặc ngọn nến, có đường kính trung bình khoảng 1 µm. Cầu khuẩn được chia thành một số loại sau:

        - Song cầu (Diplococci) là những cầu khuẩn đứng thành từng đôi như phế cầu (Streptococcus pneunoniae), lậu cầu (Neisseria gonorrhoeae) và não mô cầu (Neisseria meningitidis – Meningococcus). Nếu có nhiều đôi nối đuôi nhau chúng sẽ tạo thành chuỗi.

        - Liên cầu (Streptococci) là những cầu khuẩn đứng thành chuỗi.
      - Tụ cầu (Staphylococci) là những cầu khuẩn đứng thành từng đám như chùm nho như tụ cầu vàng.

      1.2.1.2. Trực khuẩn

          Trực khuẩn là những vi khuẩn hình que, đầu tròn hay đầu vuông, kích thước thường gặp có chiều rộng khoảng 1 µm, chiều dài khoảng 2 - 5 µm (các trực khuẩn không gây bệnh thường có kích thước lớn hơn). Dựa trên đặc điểm có thể tạo nha bào và sống hiếu khí hay kị khí, có thể chia trực khuẩn ra làm 3 loại:

         - Bacteria: là những trực khuẩn không sinh nha bào, phần lớn trực khuẩn gây bệnh thuộc loại này như trực khuẩn đường ruột...

       - Bactilli:là những trực khuẩn hiếu khí sinh nha bào như trực khuẩn than (Bacillus anthracis).

       - Clostridia: là những trực khuẩn kỵ khí sinh nha bào gây bệnh bằng ngoại độc tố như trực khuẩn uốn ván (Clostridium tetani), trực khuẩn gây bệnh ngộ độc thịt (C. Botulinum), trực khuẩn gây bệnh hoại thư (C. perfringens).

      1.2.1.3. Xoắn khuẩn (Spirochaetales)


          Xoắn khuẩn là những vi khuẩn có hình sợi lượn sóng và di động, có chiều dài có thể lên tới 30 µm. Có 3 giống vi khuẩn thuộc loại này gây bệnh quan trọng là Treponema (xoắn khuẩn giang mai – Treponema pallidum),Leptospira và Borelia.

          Ngoài những dạng điển hình trên còn có những loại vi khuẩn có hình thể trung gian.

          - Trung gian giữa cầu khuẩn và trực khuẩn là cầu - trực khuẩn, như vi khuẩn dịch hạch.

        - Trung gian giữa trực khuẩn và xoắn khuẩn là phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae).

      1.2. Cấu trúc và chức năng của tế bào vi khuẩn

      1.2.1. Nhân của vi khuẩn

          Vi khuẩn không có nhân điển hình vì không có màng nhân, nhưng có cơ quan chứa thông tin di truyền đó là nhiễm sắc thể (chromosome) tồn tại trong nguyên sinh chất. Bản chất nhiễm sắc thể là ADN có chiều dài khoảng 1 mm, khép kín, trọng lượng 2 tỷ dalton (2 x 109) chứa khoảng 3000 gen, được bao bọc bới protein kiềm. Nhiễm sắc thể có hình cầu, hình que hay hình chữ V, sao chép theo kiểu bán bảo tồn dẫn đến sự phân bào. Tuy nhiên, sự phân bào còn phụ thuộc vào sự phân chia màng sinh chất và vách tế bào.

          Ngoài nhiễm sắc thể, một số vi khuẩn còn có yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể đó là các loại plasmid và transposon.

      1.2.2. Chất nguyên sinh (cytoplasma)

          Chất nguyên sinh của vi khuẩn chứa những thành phần hoà tan như protein, peptid, acid amin, vitamin, ARN, ribosom, các muối khoáng, một số nguyên tố hiếm và sắc tố, ngoài ra nó còn chứa các hạt vùi. Bản chất hạt vùi là những không bào chứa lipid, glycogen và một số chất có tính đặc trưng cao với một số loại vi khuẩn. Vì vậy, nó có ý nghĩa trong chẩn đoán như ở vi khuẩn bạch hầu có hạt vùi chứa polymetaphosphat.

          Tuy nhiên nếu so với tế bào của vi sinh vật có nhân điển hình (eucaryote), nguyên sinh chất của vi khuẩn không có ty lạp thể, lưới nội bào và cơ quan phân bào.

      1.2.3. Màng nguyên sinh (cytoplasma membrane)

          Màng nguyên sinh là một lớp màng mỏng có tính đàn hồi, bao gồm 60% protein, 40% lipid chủ yếu là các phospholipid. Màng nguyên sinh thực hiện một số chức năng quan trọng quyết định sự tồn tại của tế bào vi khuẩn như:

        - Là nơi hấp thụ và đào thải chọn lọc các chất qua 2 chơ chế khuyếch tán bị dộng nhờ áp lực thẩm thấu với những chất có phân tử lượng thấp và vận chuyển chủ động để thực hiện với những chất có phân tử lượng cao.

        - Là nơi tổng hợp các enzym ngoại bào để phân hủy các chất có có phân tử lượng quá lớn không thể vận chuyển qua màng thành những chất có phân tử lượng thấp hơn để dễ hấp thu.

        - Là nơi tổng hợp các thành phần của vách tế bào.

        - Là nơi tồn tại của hệ thống enzym tế bào, thực hiện các quá trình năng lượng chủ yếu của tế bào vì không có ty lạp thể.

        - Tham gia vào quá trình phân bào nhờ các mạc thể (mesosome) vì là nơi gắn các nhiễm sắc thể, mạc thể thường gặp ở vi khuẩn gram (+).

        1.2.4. Vách (cell wall)

          Vách tế bào có ở mọi vi khuẩn trừ Mycoplasma.

       1.2.4.1. Cấu trúc của vách vi khuẩn

             Vách tế bào là bộ khung vững chắc bao bên ngoài màng sinh chất, được cấu tạo bới đại phân tử glycopeptid, được tổng hợp liên tục bao gồm đường amin và acid amin. Các acid amin khác nhau tùy từng vi khuẩn. Chính vì vậy, vách của các vi khuẩn Gr(+) và Gr(-) có những đặc điểm khác nhau.

     1.2.4.2. Chức năng của vách vi khuẩn

          Chức năng quan trọng nhất của vách vi khuẩn là duy trì hình dạng vi khuẩn. Sự khác nhau về thành phần vách tế bào của các loại vi khuẩn khác nhau có thể là nguyên nhân của tính chất ưa các loại thuốc nhuộm khác nhau. Đối với vi khuẩn Gr (+) do vách của vi khuẩn dầy, nên phức hợp iod-gentian không thể thấm ra ngoài sau khi vi khuẩn đã bị tẩy bằng cồn, nên vi khuẩn Gr (+) vẫn giữ được mầu tím, còn vi khâẩn Gr(-) bị mất mầu này sau khi tẩy cồn.

        Vách vi khuẩn quyết định tính chất kháng nguyên thân của vi khuẩn, là cơ sở để xác định và phân loại vi khuẩn.

          Vách tế bào là nơi tác động của nhóm kháng sinh beta lactam, đồng thời là nơi tác động của lysozym.

        Ngoài ra, vách tế bào còn là nơi tiếp nhận (receptor) đặc hiệu cho thực khuẩn thể (bacteriophage), có ý nghĩa quan trọng trong phân loại vi khuẩn.

     1.2.5. Vỏ (capsule)

          Vỏ của vi khuẩn là một lớp nhầy lỏng lẻo, không rõ rệt bao quanh vi khuẩn, được quan sát bằng phương pháp nhuộm mực nho. Chỉ có một số loài vi khuẩn và trong những điều kiện nhất định mới hình thành vỏ. Khuẩn lạc của những vi khuẩn có vỏ thường nhầy, ướt và sáng.

        Vỏ của vi khuẩn đóng vai trò bảo vệ cho vi khuẩn trong những điều kiện nhất định. Ngoài ra, vỏ của vi khuẩn còn có gữi được khả năng gây bệnh của vi khuẩn, ví như các chủng phế cầu không tổng hợp được vỏ đều không có khả năng gây bệnh vì chúng nhanh chóng bị thực bào bởi cơ chế bảo vệ của cơ thể.

      1.2.6. Lông (flagella)

          Lông là những sợi protein dài và xoán tạo thành từ các acid amin dạng D. Lông là cơ quan di dộng trong môi trường thích hợp, nó chỉ có ở một số loại vi khuẩn nhất định. Vị trí lông của các vi khuẩn cũng có đặc điểm khác nhau, là đặc điểm để phân loại vi khuẩn ví dụ như phẩy khuẩn tả có lông ở một đầu, nhiều loại vi khuẩn khác có lông quanh thân như (Salmonella, E.coli), một vài vi khuẩn khác lại có một chùm lông ở đầu.

      1.2.7. Pilli

          Pili là cơ quan phụ của vi khuẩn như lông, nó có thể mất đi nhưng không ảnh hưởng tới sự tồn tại của vi khuẩn.

          Chức năng chính của pili là để bám vào các tế bào có màng nhân (eucaryote), khả năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn cũng liên quan đến sự tồn tại của pili, nếu vi khuẩn lậu mất pili sẽ không thể gây bệnh được. 

      1.2.8. Nha bào

          Nhiều loại vi khuẩn có khả năng tạo nha bào khi điều kiện sống của chúng không thuận lợi. Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một nha bào, khi điều kiện sống thuận lợi, nha bào vi khuẩn lại nẩy mần để đưa vi khuẩn trở lại dạng sinh sản.

          Nha bào có thể tồn tại lâu tới 150.000 năm, do ở dạng nha bào không có sự chuyển hoá và mất nước.

     1.3. Sinh lý của vi khuẩn

          Vi khuẩn là một sinh vật, nên chúng cũng có khả năng dinh dưỡng, hô hấp, chuyển hoá và sinh sản như các sinh vật khác

      1.3.1. Dinh dưỡng của vi khuẩn

          Trong quá trình sinh sản và phát triển, vi khuẩn cần một lượng thức ăn bằng trọng lượng cơ thể chúng, vì vi khuẩn phát triển nhanh. Trong tự nhiên có thể có những vi khuẩn có thể tổng hợp được mọi enzym từ một hợp chất carbon để hình thành chất chuyển hoá tham gia vào quá trình chuyển hoá. Tuy nhiên cũng có những vi khuẩn (biến chủng) chỉ phát triển trong những môi trường có các chất cần thiết gọi là yếu tố phát triển. Ví dụ, Escherichia coli là một vi khuẩn đường ruột không cần yếu tố phát triển; ngược lại, Proteus vulgaris cũng là vi khuẩn đường ruột gần với E. Coli nhưng chỉ phát triển trong môi trường có amid nicotinic vừa đủ.

        Vi khuẩn là đơn bào, nên dinh dưỡng nhờ cơ chế thẩm thấu của màng nguyên sinh chất. Mỗi loại vi khuẩn có tính thẩm thấu khác nhau. Vi khuẩn non có tính thảm tháu cáo hơn vi khuẩn già. Những thức ăn không hoà tan thì không thẩm thấu được, vi khuẩn phải dùng enzym của mình để làm tan thức ăn rồi mới hấp thu thẩm thấu được.

     1.3.2. Hô hấp của vi khuẩn

          Hô hấp là quá trình trao đổi chất, tạo năng lượng cần thiết để tổng hợp nên các chất mới của tế bào. Các vi khuẩn gây bệnh lấy năng lượng từ một cơ chất carbon bằng cách oxy hoá.

        Nhiều loại vi khuẩn dùng oxy của khí trời để oxy hoá lại coenzym khử, chúng là những vi khuẩn hiếu khí. Tuy nhiên một số loại vi khuẩn không thể sử dụng oxy tự do, nên chúng không thể phát triển được hoặc kém phát triển trong môi trường có oxy tự do. Những vi khuẩn này gọi là vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối. Tuy nhiên, có một số loại vi khuẩn hiếu khí có thể phát triển được trong điều kiện không có không khí – đó là những vi khuẩn hiếu khí, kị khí tùy ngộ, ví dụ trực khuẩn mủ xanh là vi khuẩn có hai khả năng hô hấp hiếu khí và kỵ khí.

     1.3.3. Chuyển hoá của vi khuẩn

          Vi khuẩn sinh sản và phát triển được nhờ có hệ thống enzym. Mỗi loại vi khuẩn khác nhau có hệ thống enzym khác nhau. Bản chất của enzym là protein. Những enzym có khối lượng phân tử lớn dễ bị phá hủy bởi nhiệt độ. Enzym của vi khuẩn được chia thành nhiều loại dựa theo tính chất phản ứng như enzym thủy phân, oxy hoá, khử hydro, khử CO2, thêm CO2... hoặc theo chất bị tác dụng như enzym phân hủy protein, glucid, lipid, acid nucleic... hoặc dựa theo vị trí của enzym ở trong vi khuẩn hay ngoài vi khuẩn để chia ra enzym nội bào hay enzym ngoại bào. Enzym nội bào tham gia vào quá trình chuyển hoá trong cơ thể của vi khuẩn. Enzym ngoại bào dùng để phân hủy các chất có phân tử lượng lớn thành các chất có phân tử nhỏ để dễ hấp thu.

        Có một số chất được vi khuẩn hình thành trong quá trình chuyển hoá như nội độc tố, ngoại độc tố và chất kháng kháng sinh. Ngoại độc tố được vi khuẩn tiết ra ngoài tế bào là một protein tan được trong nước, độc tính của ngoại độc tố rất cao, chỉ cần 0,02 mg ngoại độc tố bạch hầu cũng gây chết người hoặc với độc tố uốn ván chỉ cần 0,00006 mg cũng gây chết người. Nội độc tố là chất độc của trực khuẩn gram âm. Tác dụng độc lực của nội độc tố không mạnh bằng ngoại độc tố, như nội độc tố thương hàn phải cần 400 mg mới gây chết người. Nội độc tố nằm trong vách của vi khuẩn, chỉ khi vi khuẩn bị phá vỡ nó mới được giải phóng.

     1.3.4. Sự phát triển của vi khuẩn

          Vi khuẩn muốn phát triển đòi hỏi phải có môi trường có đủ các yếu tố dinh dưỡng được gọi là môi trường dinh dưỡng hay môi trường cơ bản có pH từ 7,2 – 7,4. Môi trường canh thang là môi trường lỏng và thạch thường là môi trường canh thang cho thêm thạch để làm đặc lại.

        Vi khuẩn chỉ phát triển trong những điều kiện thích hợp về nhiệt độ, phần lớn vi khuẩn gây bệnh có nhiệt độ phát triển thích hợp là 37oC, tuy nhiên chúng có thể phát triển ở nhiệt độ 20oC - 42oC, cá biệt có thể ở 4oC. Ngoài ra, các vi khuẩn còn cần khí trường thích hợp để phát triển như với vi khuẩn hiếu khí cần oxy, các vi khuẩn kỵ khí không cần oxy hoặc một số vi khuẩn cần có CO2.  
    
1.3.4.1. Sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường lỏng

          Trong nghiên cứu hoặc chẩn đoán, môi trường lỏng chỉ có giá trị khi nó chứa một chủng vi khuẩn (chỉ có một clon) và như vậy ta có một canh khuẩn thuần khiết. Trong thực tế, đa số bệnh phẩm đều nhiễm nhiều loại vi khuẩn nên không thể cấy vào môi trường lỏng trừ một số ngoại lệ như máu bệnh nhân, dịch não tủy. Tuy nhiên, vẫn có thể có kết quả sai do nhiễm khuẩn từ ngoài vào trong quá trình lấy mẫu.

        Để đo sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường lỏng thường đo độ đục của canh khuẩn để xác định mật độ quang học D. Đây là phương pháp nhanh và chính xác, áp dụng được từ 107 vi khuẩn trong 1 ml trở lên. D luôn tỷ lệ với khối lượng vi khuẩn, nhưng không tỷ lệ tuyệt đối với số lượng vi khuẩn.

      1.3.4.2. Sự phát của vi khuẩn trong môi trường đặc

        Nhờ độ quánh của môi trường đặc, trong quá trình phát triển, vi khuẩn nhanh chóng tạo thành khuẩn lạc có quan sát bằng mắt thường. Nếu ria cấy vi khuẩn trên môi trường đặc để vi khuẩn nọ đủ cách xa vi khuẩn kia, thì mỗi vi khuẩn sẽ tạo thành một khuẩn lạc riêng rẽ (một clôn). Dựa vào tính chất cơ bản này để tạo được canh khuẩn thuần khiết, gồm các vi khuẩn cùng mang gen di truyền giống nhau (trừ biến dị) và tính chất sinh lý giống nhau. Do vậy, môi trường đặc có rất nhiều ứng dụng trong phân lập các vi khuẩn gây bệnh với các loại môi trường như môi trường thạch thường, thạch sâu và môi trường chọn lọc
.
     1.3.5. Xác định tính chất sinh vật hoá học của vi khuẩn

        Mỗi loại vi khuẩn có một quá trình chuyển hoá riêng, dựa vào tính chất sinh vật hoá học của chúng để xếp loại vi khuẩn.

     2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN


      2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn

        Phân lập là khâu quan trọng trọng trong quá trình nghiên cứu vi khuẩn. Mục đích của phân lập là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các clon thuần khiết để khảo sát và định loại. Khi vi khuẩn tăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn đã tạo ra những khuẩn lạc, hình thái của các khuẩn lạc mang tính đặc trưng của từng loài vi khuẩn. Việc mô tả chính xác các khuẩn lạc đã tách rời có thể góp phần rất quan trọng trong việc định danh vi khuẩn. Các nhà vi khuẩn học đã tiêu chuẩn hoá có ý nghĩa khi miêu tả hình dáng, độ cao và bờ, rìa của khuẩn lạc. 


Hình thái khuẩn lạc

          Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Muốn vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết khác đều phải được khử trùng thích hợp để được vô trùng trước khi sử dụng.

      2.1.1. Các dạng mẫu cho nuôi cấy

     -  Dạng dịch mẫu đã được đồng nhất, dịch nuôi cấy hoặc môi trường lỏng chứa chủng vi sinh vật cần phântích.

   - Dạng trên bề mặt môi trường rắn chứa thạch (1,5-2%) trong ống thạch nghiêng hay trong đĩa petri.

      -  Dạng mẫu nằm sâu trong môi trường rắn trong ống nghiệm thạch sâu chứa thạch mềm (0,5-0,7%).

        2.1.2. Dụng cụ cấy

          - Que cấy thẳng: Que cấy kim loại có đầu nhọn, thường dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty.

          - Que cấy móc: que cấy có đầu vuông góc, thường dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty.

              - Que cấy vòng (Que khuyên cấy): que cấy kim loại đầu có vòng tròn, thường dùng cấy chủng từ môi trường rắn hoặc lỏng lên môi trường rắn, lỏng.

             - Que cấy trang: bằng kim loại hay thủy tinh, đầu hình tam giác, dùng để dàn trải vi khuẩn trên bề mặt thạch rắn.

             - Ống hút thủy tinh dùng để chuyển một lượng vi khuẩn nhất định lên bề mặt môi trường rắn hoặc vào môi trường lỏng. Hiện nay, pipet cấy chuyển với những đầu tip vô trùng có thể tháo rời để thay đổi (còn gọi là pipet đầu rời hay transfer pipet dạng hút thông thường).

          -Đầu tăm bông vô trùng để cấy giống từ môi trường lỏng lên bề mặt của môi trường rắn.

      2.1.3. Các thao tác vô trùng

             Thao tác cấy được thực hiện trong một không gian vô trùng tạo bởi ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn Bunsen. Ngọn lửa đèn cồn, đèn Bunsen có tác dụng oxy hóa không khí tạo không gian vô trùng, đồng thời còn được dùng để đốt khử trùng que cấy, miệng chai lọ, ống nghiệm khi mở, đóng, nút bông, nắp nhựa…

          Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, nhân viên thao tác cần mang găng tay hoặc tiến hành sát trùng tay bằng cồn 70o hoặc các dung dịch diệt khuẩn, tương tự như vậy tiến hành sát trùng mặt bàn thao tác trước khi bắt đầu thao tác vô trùng. Sau khi hoàn tất việc cấy chủng, tiến hành sát trùng tay, mặt bàn làm việc tương tự như trên trước khi rời phòng kiểm nghiệm.

      2.1.4. Kỹ thuật cấy ria trên đĩa petri

        - Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng nhúng vào dịch mẫu để có được các vi khuẩn cần phân lập.

     - Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thạch thích hợp. Sau mỗi đường ria liên tục, đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo.

    - Lật ngược đĩa, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.

      2.1.5. Kỹ thuật cấy trang

    - Dùng pipet chuyển 0,1ml dịch canh khuẩn lên bề mặt môi trường thạch trong đĩa pettri.

      - Nhúng đầu thanh gạt vào cồn, hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.

      -  Mở đĩa petri, đật nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt trải đều dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch. Trong khi thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng nửa chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch vi khuẩn đều khắp bề mặt môi trường.

     - Lật ngược đĩa, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ổn nhiệt.

      2.2. Cấy chuyển

      2.2.1. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng

      - Đốt nóng đỏ đầu que cấy trong ngọn lửa và hơ nhẹ phần cán (phần sẽ đưa vào bên trong dụng cụ chứa vi sinh vật). Cầm thẳng đứng que cấy cho que cấy nóng đều.

      - Tay trái cầm ống nghiệm xoay nhẹ, tay phải cầm que cấy. Ngón út của tay phải dùng để mở nút bông.

      - Mở nút bông xoay miệng ống nghiệm qua ngọn lửa.

      -  Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm, làm nguội que cấy bằng cách áp đầu que cấy vào thành ống cho nguội. Thu sinh khối bằng cách nhúng que cấy vào môi trường lỏng, rút thẳng que cấy ra không để dính vào thành và miệng ống. Hơ nóng miệng ống nghiệm, đậy nút bông. Đặt ống nghiệm vào giá đỡ.

      - Đầu que cấy có chứa vi khuẩn được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn. Dùng tay trái lấy ống nghiệm chứa môi trường mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm rồi đưa đầu que cấy vào bên trong môi trường.

      - Nhúng và khuấy nhẹ que cấy trong dịch môi trường để tách sinh khối ra khỏi đầu que cấy.

      - Rút thẳng đầu que cấy ra. Khử trùng miệng ống nghiệm, đậy nút bông lại.

      - Khử trùng que cấy ngay sau khi cấy xong.

       2.2.2. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống thạch nghiêng

           Tiến hành tương tự như trên với một số khác biệt sau: cấy giống lên bề mặt thạch nghiêng bằng cách đặt nhẹ đầu que cấy lên bề mặt môi trường ở đáy ống, sau đó cấy theo hình chữ chi từ đáy ống nghiệm lên đến đầu trên của mặt thạch nghiêng.

        2.2.3. Cấy giống từ môi trường lỏng bằng pipet đầu rời

           Pipet đầu rời cho phép thao tác chính xác với những dung tích nhỏ. Trong thao tác vô trùng, pipet đầu rời rất hữu dụng vì cho phép cấy chuyển dễ dàng dịch vi khuẩn lên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri nhằm tạo khuẩn lạc rời hoặc vào ống nghiệm hay bình chứa môi trường lỏng để nuôi tăng sinh. Bằng một pipet đầu rời người ta có thể thực hiện với số lần không hạn chế các thao tác vô trùng này do có thể hấp khử trùng đồng loạt với số lượng lớn các đầu tip. Trước khi sử dụng, kiểm nghiệm viên cần biết các yêu cầu cơ bản khi thao tác với pipet đầu rời như sau:

      -  Mỗi pipet đầu rời đều có giới hạn dung tích thao tác cho phép nhất định. Thông thường các dải dung tích đó là: 0,1 ml, 1- 20 ml, 20- 200 ml, 0,2- 1 ml, 1-5 ml, 1- 10 ml. Dải dung tích thao tác cho phép này thường được ghi rõ trên pipet đầu rời. Trong dải dung tích cho phép, kiểm nghiệm viên có thể điều chỉnh để có dung tích chính xác cần thao tác. Cần chọn pipet đầu rời với giới hạn dung tích thích hợp cho phạm vi thao tác. Mỗi loại pipet đầu rời đều có đầu tip tương ứng và có thể được khử trùng bằng nồi hấp áp suất. 

      - Pipet đầu rời thường có hai nấc: nấc 1 tương đương với dung tích được chọn sử dụng khi hút dung dịch, nấc 2 vượt quá nấc 1 được sử dụng khi bơm dung dịch ra khỏi đầu tip của pipet đầu rời.

      - Khi sử dụng pipet đầu rời để cấy chuyển dịch giống cần tiến hành thao tác trong không gian vô trùng của ngọn lửa trong tủ cấy:

      - Tay phải cần pipet đầu rời, tay trái mở hộp chứa đầu tip vô trùng. Cắm đầu pipet vào đầu tip.

      - Dùng tay trái giữ ống nghiệm, bình chứa dịch giống vi sinh vật. Dùng ngón út và áp út của tay phải đang giữ pipet để kẹp giữ và mở nút bông, hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm hoặc bình chứa.

      - Đưa đầu tip vô trùng vào bên trong dịch giống, hút lấy dung tích cần thiết.

      - Rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình chứa và đậy bằng nút bông đang được giữ ở ngón út và áp út của tay phải.

       - Đầu tip có chứa vi sinh vật được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn.

      - Dùng tay trái lấy ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường mới, dùng ngón út và áp út kẹp và mở nút bông, khử trùng miệng bình chứa.

       - Đưa đầu tip vào bên trong môi trường và bơm dịch giống vào môi trường.

       - Rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình, đậy nút bông.

      - Thay đầu tip vô trùng mới khi thực hiện đợt cấy tiếp theo.

      - Thực hiện tương tự trong trường hợp cấy chuyển dịch giống lên bề mặt môi trường trong đĩa petri.

      - Cần lưu ý đầu pipet đầu rời và đầu tip được chế tạo bằng polymer nên tuyệt đối khử trùng đầu pipet và đầu tip bằng ngọn lửa.

           Để đảm bảo sự phát triển của vi khuẩn, sau khi cấy xong phải quan tâm đến các điều kiện môi trường nuôi vi khuẩn bao gồm: (1) Nhiệt độ, phải chọn nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của mỗi loài vi khuẩn và duy trì ổn định nhiệt độ đó; (2) Độ ẩm, để duy trì độ ẩm trong quá trình nuôi ủ, cần đảm bảo đủ lượng nước khi làm môi trường. (3) Khí oxy đối với vi sinh vật hiếu khí, lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải để oxy không khí có thể thấm vào.

      2.3. Quy trình nhân giống và bảo quản chủng vi sinh vật chuẩn

        2.3.1. Nguồn gốc

           Chủng chuẩn cung cấp cho phòng thí nghiệm phải có nguồn gốc từ các nhà cung cấp hay tổ chức cung cấp giống vi khuẩn có uy tín, có chức năng cung cấp chủng giống vi khuẩn.
           Giống được cung cấp phải đảm bảo yêu cầu về chất lượng, hoạt tính, có thông tin về các đặc điểm về sinh hóa, tính chất kháng nguyên.

           Khi được nhà cung cấp chuyển đến phòng thí nghiệm các ống chủng vi khuẩn phải có nhãn ghi đầy đủ tên, mã số, ký hiệu chủng loại kèm theo hướng dẫn bảo quản, số lần cấy chuyền (số thế hệ) và các đặc điểm sinh hóa, kháng nguyên.

      2.3.2. Nhân giống và bảo quản

          Chủng giống dạng đông khô từ các ngân hàng giống được coi là giống gốc. Từ đây chủng được nhân lên trong môi trường canh thang (lần cấy chuyền thứ nhất).

          Vi sinh vật từ môi trường canh thang được cấy chuyển vào môi trường thạch dinh dưỡng Tryptose Soy Agar (TSA – 1 đĩa và 15 ống thạch nghiêng) và môi trường chọn lọc.

             - Môi trường thạch không chọn lọc: ủ ở 370C 24 giờ, kiểm tra độ thuần chủng trên đĩa TSA. Số lượng ống chủng phụ thuộc vào nhu cầu của phòng. Kiểm tra lại và loại bỏ những ống củng không đạt yêu cầu. Bảo quản các ống chủng ở 40C, thời gian bảo quản tối đa là 3 tháng. Các chủng này được dùng làm đối chứng trong các lần phân tích mẫu.

             - Môi trường thạch chọn lọc: cấy chủng từ môi trường canh thang trên lên môi trường thạch chọn lọc. Sau khi ủ, chọn một số khuẩn lạc để kiểm tra lại mức độ thuần khiết, các đặc tính sinh hóa và đặc tính kháng nguyên.

             Khi ống chủng sắp hết thời gian bảo quản cho một lần cấy chuyển, các chủng giống được nhân lên trong môi trường canh thang dinh dưỡng và cấy chuyền vào các ống thạch nghiêng để bảo quản tương tự như trên.

          Với một chủng vi khuẩn chuẩn chỉ được cấy tối đa 5 lần kể từ lần nhân giống đầu tiên. Sau mỗi lần cấy chuyển đều phải kiểm tra lại hoạt tính và độ thuần chủng. Khi hết thời hạn cấy chuyển phải thay chủng giống mới.

      2.3.4. Sử dụng chủng chuẩn trong phân tích mẫu

          Các chủng chuẩn trong môi trường thạch nghiêng trước khi sử dụng làm mẫu chứng dương được cấy sang môi trường thạch đĩa không chọn lọc (Plate Count Agar, Tryptose Soy Agar hay Nutrien Agar) nhằm kiểm tra độ thuần khiết, các đĩa này được bảo quản và sử dụng trong một tuần.

      2.3.5. Chú ý khi sử dụng chủng chuẩn

          Các chủng chuẩn phải được sử dụng và bảo quản cẩn thận ở 40C, mỗi ống chủng phải có nhãn mác ghi các thông tin như: tên, ký hiệu chủng, ngày, số lần cấy chuyển…

          Kiểm nghiệm viên phải thận trọng và tuân thủ các quy định về an toàn phòng kiểm nghiệm khi cấy chuyển thao tác với các chủng chuẩn để tránh nhiễm bệnh hay làm lây lan mầm bệnh.

          Dụng cụ sau khi tiếp xúc với các chủng vi khuẩn phải đựơc thanh trùng cẩn thận. Dụng cụ thủy tinh và các đĩa petri sau khi dùng phải được hấp khử trùng ở 121oC 20 phút trước khi đem rửa, dụng cụ thủy tinh được ngâm trong dung dịch chlorin, sau đó rửa bằng xà phòng và tráng lại bằng nước sạch trước khi phơi khô.

      2.4. Phương pháp soi tươi
 
          Có thao tác đơn giản, tiến hành nhanh, thường được sử dụng để quan sát trạng thái sống của tế bào vi khuẩn.

      2.4.1. Phương pháp thực hiện

      2.4.1.1. Dụng cụ

        - Lam kính: dùng làm tiêu bản.

        - Lam phủ (lamel, kính phủ vật): dùng để đậy lên các tiêu bản.

        - Lam kính lõm: dùng để quan sát khả năng di động của vi khuẩn.

      2.4.1.2. Chuẩn bị giọt canh khuẩn từ môi trường nuôi cấy

      - Đặt ống chứa vi khuẩn vào giữa ngón cái và ngón trỏ của bàn tay trái, lòng bàn tay ngửa ra, ống nghiệm để hơi nghiêng nhưng không được để cho canh khuẩn chạm vào nút bông của ống nghiệm nuôi cấy vi khuẩn.

      - Khử trùng que cấy trên ngọn đèn cồn. Để que cấy thẳng đứng trên ngọn lửa cho đến khi đầu que cấy nóng đỏ rồi từ từ đặt và di chuyển que cấy theo chiều nằm ngang trên ngọn lửa.

      - Kẹp nút bông vào giữa ngón út và lòng bàn tay phải, xoay nhẹ nút một vòng và kéo nút ra. Giữ nút như vậy cho đến khi đậy nút vào.

      - Đốt miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn.

      - Đưa que cấy đã nguội vào ống nghiệm để lấy mẫu. Nếu ống giống là môi trường lỏng thì chỉ cần nhúng đầu que cấy vào canh trường rồi rút ra. Nếu giống mọc trên môi trường đặc thì dùng que cấy lấy một ít sinh khối vi sinh vật trên mặt thạch và hòa đều vào giọt nước cất vô trùng trên lam kính. Chú ý thao tác hết sức nhẹ nhàng để khi lấy mẫu vi khuẩn không làm rách mặt thạch.

    - Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm, đậy ống nghiệm lại và đặt ống vào 
vào giá.

      - Đặt giọt canh khuẩn (hoặc sinh khối vi sinh vật) ở đầu que cấy vào giữa phiến kính để làm tiêu bản.

      - Khử trùng lại que cấy trên ngọn đèn rồi cất vào giá.

      2.4.1.3. Tiêu bản giọt ép

      - Dùng que cấy hoặc ống hút káy giống vi sinh vật để làm vết bôi.

      - Đặt một mép kính phủ vật tiếp xúc với lam kính một góc 450 rồi từ từ hạ xuống phủ giọt canh khuẩn thật nhẹ nhàng, tránh không tạo thành bọt khí.

         2.4.1.4. Tiêu bản giọt treo

          Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.
      - Cho một giọt canh khuẩn lên giữa kính phủ vật. Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh khuẩn quay xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính.

      - Chú ý không giọt canh khuẩn lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm.

      - Đặt tiêu bản lên kính hiển vi và quan sát ở vật kính 10x hoặc 40x.

     Trên thị trường hiện nay đã xuất hiện một dụng cụ có tên gọi là vòng O (O-ring) dùng để thực hiện giọt treo mà không cần lam kính lõm. Đây là một miếng đệm hình tròn, có kích thước vòng trong 12 mm, cao 3 mm có thể sử dụng nhiều lần. Khi thực hiện, người ta đặt vòng O lên giữa lam kính thường, đưa giọt canh khuẩn vào một mặt của kính phủ vật, xoay ngược kính phủ vật và úp lên vòng O. Đây là cải tiến của nhà sản xuất Science Kit, một bộ O- ring 25 chiếc có giá khoảng 20 USD.

      2.5. Phương pháp nhuộm gram
 
          Năm 1884, Hans Christian Joachim Gram, một nhà khoa học người Đan Mạch đã sáng chế ra phương pháp nhuộm vi khuẩn mới mà ngày nay tên gọi đã trở lên rất quen thuộc với mọi phòng thí nghiệm vi khuẩn thế giới:
 
             Phương pháp nhuộm gram là một trong những kỹ thuật cơ bản và quan trọng nhất trong phân tích vi khuẩn ở giai đoạn đầu nhằm xác định sơ bộ đặc tính của các dòng vi khuẩn muốn nghiên cứu theo tính chất bắt mầu gram của chúng. Vi khuẩn bắt mầu hỗn hợp crystal violet - iodin sẽ có màu tím nâu khi quan sát dưới kính hiển vi quang học và được xếp vào nhóm vi khuẩn gram dương. Những dòng vi khuẩn khác không giữ được mầu crystal violet và bắt mầu fuchsin (đỏ) được xếp vào nhóm vi khuẩn gram âm.
 
          Phương pháp nhuộm gram dựa vào khả năng lưu giữ crystal violet của thành tế bào các dòng vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn. Việc xác định thời gian tẩy mầu là yếu tố quan trọng trong việc phân biệt vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm. Nếu kéo dài thời gian tẩy mầu, ngay cả vi khuẩn gram dương cũng không giữ được mầu nhuộm ban đầu. Ngoài ra, một số loài vi khuẩn gram dương cũng có thể bị tẩy mầu dễ dàng và vì thế chúng được coi là các dòng vi khuẩn có tính chất bắt mầu gram thay đổi (có thể âm lẫn dương). Chất nhuộm fuchsin (hoặc có thể thay bằng safranin) tạo cho vi khuẩn gram âm có mầu hồng đỏ. Fuchsin nhuộm mầu mạnh hơn và có mầu dễ nhìn hơn safranin. (Haemophilus spp., và một vài dòng vi khuẩn kỵ khí không ăn màu safranin)

      2.5.1. Kỹ thuật nhuộm gram

      2.5.1.1. Pha dung dịch thuốc nhuộm

      a) Dung dịch Cristal violet:

 * Dung dịch A:

- Crystal violet………………2 g

- Ethanol 95% ………………20 ml

* Dung dịch B:

- Ammonium oxalat …………………0,8

- Nước cất……………………………..80 ml

          Trộn đều 2 dung dich A và B, lọc qua giấy lọc thô, giữ ở nhiệt độ phòng trong chai mầu nâu.

      b) Dung dịch Lugol:

- Indin tinh thể……………………….1 g

- Potasium iodid……………………...2 g

- Nước cất..............................................300 ml

          Nghiền Iodin vào Potassium iodid trong 50 ml nước cất cho hòa tan hoàn toàn. Thêm phần nước cất còn lại, giữ ở nhiệt độ phòng trong chai nâu. Khi dung dịch mất mầu phải pha lại.

    c) Dung dịch Carbon fuchsin:

* Dung dich A:

- Fuchsin………………………………0,3 g

- Ethanol 95%........................................10 ml

* Dung dịch B

- Phenol nóng chảy…………………….5 ml

- Nước cất………………………………95 ml

Trộn đều dung dịch A và dung dich B, lọc qua giấy lọc thô.

      d) Dung dịch Acid Alcohol:

- HCL…………………………………..3 ml

- Ethanol cho đủ………………………..100 ml

      2.5.1.2. Cố định phiến phết

      a) Từ môi trường lỏng

        - Dùng bút sáp để ghi tên mẫu hoặc số nhận diện, ngày thử nghiệm. Vẽ vòng tròn để giới hạn vùng phiến phết vi khuẩn.

        - Dùng khuyên cấy lấy một khuyên dịch khuẩn, dàn đều thành lớp mỏng giới hạn trong vòng tròn đã vẽ trên lam kính. Để dịch khuẩn tự khô hoàn toàn.

        - Hơ mặt dưới của lam kính qua lai trên ngọn lửa 2- 3 lần, tránh không để tiêu bản quá nóng.

      b) Từ môi trường rắn

        - Dùng bút sáp để ghi tên mẫu hoặc số nhân diện, ngày thử nghiệm. Vẽ vòng tròn để giới hạn vùng phiến phết vi khuẩn.
        - Dùng khuyên cấy lấy một khuyên cấy nước cất vô trùng đặt vào giữa vòng tròn đã vẽ, lấy một lượng nhỏ vi khuẩn từ khuẩn lạc và dàn mỏng với nước cất trong vòng tròn. Để dịch khuẩn tự khô hoàn toàn.
        - Hơ mặt dưới của lam kinh qua lại trên ngọn lửa 2 đến 3 lần, tránh không để tiêu bản quá nóng.

      2.5.1.3. Tiến hành nhuộm

        - Phủ dung dịch lên lam kính đã được cố định trong 1 phút.
        - Đổ bỏ dung dịch Crustal violet và rửa với nước cất.
        -  Phủ dung dịch làm cắn màu lugol trong 1 phút, sau đó đổ bỏ dung dịch lugol và rửa nhẹ với nước.
        - Cầm một đầu lam kính, nhỏ từ từ cồn 950 cho đến khi vùng phiến kính bạc màu di ( thời gian tẩy cồn thông thường từ 10-15 giây). Rửa ngay với nước để chấm dứt công đoạn tẩy màu.
        - Phủ dung dịch fuchsin lên lam kính 30 giây, đổ bỏ dung dịch và rửa qua nước.
        - Dùng giấy thấm để thấm khô hoặc để khô tự nhiên. Khảo sát hình thể và tính chất bắt mầu của vi khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu.

      2.5.2. Nguyên nhân một số sai lệch trong phương pháp nhuộm gram

      2.5.2.1. Gram dương trở thành gram âm

        - Lứa cấy quá già: vi khuẩn trong quá trình biến dưỡng sinh ra một số chất có khả năng làm tăng tính acid của môi trường nuôi cấy gây sai lệch kết quả. Tốt nhất lên nhuộm gram với lứa cấy từ 18-24 giờ.
        - Dung dịch Lugol bị hỏng: phải bảo quản dung dịch lugol trong chai nâu, tránh ánh sáng và cần loại bỏ ngay khi thấy dung dịch chuyển màu từ nâu sang vàng.
        - Tẩy màu quá mức: nhỏ quá nhiều cồn hoặc không rửa nước ngay.

      2.5.2.2. Gram âm trở thành gram dương

             - Cố định tiêu bản khi còn ướt, các hợp chất protein có trong môi trường họăc trong mẫu thử làm tiêu bản khó tẩy màu.
        - Tẩy màu chưa đạt.


Phản ứng với thuốc nhuộm của các chủng vi khuẩn
                   A: E. coli, gram (-)

                   B: Staphylococcus epidermidis, Gram (+)

                   C: Bacillus cereus, Gram (+).
 
      2.6. Các thử nghiệm sinh vật hoá học
 
      2.6.1. Lên men đường

          Thử nghiệm lên men trong môi trường canh thang có chứa đường, pepton và cao thịt (để cung cấp các dinh dưỡng phụ cho các vi sinh vật khó lên men), và chất chỉ thị mầu tía cresol brom (chất chỉ thị pH). Nếu có sự lên men đường, thường sinh ra acid. Trường hợp này pH môi trường giảm xuống đã làm cho màu tía cresol brom chuyển từ xanh sang vàng. Cũng như vậy, nếu thêm ống Durham, sẽ cho phép xác định sự sinh hơi (H2) từ quá trình lên men. Kết quả trả lời cuối cùng là sinh acid (+/-) và gas (+/-).

          Phản ứng lên men trong MT canh thang:

        Nếu vi khuẩn không lên men với test đường thì thuốc nhuộm màu tía vẫn còn lại và không sinh gas (trái). Nếu quả trình lên men xảy ra, hầu hết là sinh ra acid, khi đó pH giảm và làm đổi màu của canh thang sang màu vàng (giữa). Nếu sinh gas, ống Durham ở trong đảo ngược lên và nhìn như có bong bóng (phải).


2.6.2. Thủy phân tinh bột

          Đĩa thạch tinh bột được sử dụng để thử tính chất thủy phân tinh bột ngoại bào. Tinh bột là 1 phân tử polysacchrid có trọng lượng quá lớn để có thể dịch chuyển vào trong tế bào mà bước đầu không cần bẻ gãy thành những đơn vị nhỏ hơn. Khả năng thủy phân tinh bột phụ thuộc vào sự sản xuất và bài tiết một số men để giáng phân polymer. Sự phá vỡ tinh bột được nhận thấy sau khi ủ ngập đĩa với iod. Phức hợp iod với tinh bột nguyên chất có màu xanh. Nếu vi khuẩn có khả năng phá hủy tinh bột, không có phản ứng xảy ra và ta thấy xuất hiện một vùng trống (không màu) quanh khuẩn lạc.
        Thủy phân tinh bột:

          Các vi khuẩn có khả năng sử dụng tinh bột để tiết ra men amylase, men này được dùng để thủy phân tinh bột. Quá trình tinh bột bị phá vỡ được quan sát thấy khi ta ngâm đĩa tinh bột với iod, quá trình đó đã tạo ra phức hợp màu tía.

        Các vi khuẩn thử nghiệm không có khả năng phá vỡ tinh bột sẽ tạo ra đường viền đầy đủ do một vùng màu tía (trái). Khi tinh bột bị phá vỡ sẽ tạo ra một vùng sáng xung quanh đường cấy, trong khi nền của đĩa là màu tía (phải). 


2.6.3. Thử nghiệm Catalase

          Môi trường thạch tim (HIA) được sử dụng như một môi trường cho nhiều mục đích, như để xác nhận hình thái khuẩn lạc và phản ứng catalase. Trong suốt quá trình chuyển hoá oxy được tạo ra đã làm nhiễm độc các tế bào, khi đó các enzym đặc biệt của vi khuẩn được tạo ra để giải độc những hợp chất đó. Một trong các enzym đó là catalase có tác dụng phân giải H2O2 tạo thành oxy và nước. Đây là một thử nghiệm dễ dàng để phát hiện enzym này trong vi khuẩn khi sử dụng H2O2  3%. 
Phản ứng catalase với các chủng thử nghiệm


2.6.4. Giáng hoá tryptophan thành Indole 

          Canh thang Tryptone chứa nồng độ cao amino acid tryptophan. Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy tryptophan thành indole và khả năng này được dùng để phân biệt các vi khuẩn. Thử nghiệm được thực hiện bằng cách thêm chất thử Kovac vào canh cấy, kết quả là nếu xuất hiện indole thì sẽ có vòng màu đỏ ở phía trên của canh cấy. Ví dụ, phản ứng dương tính và âm tính của thử nghiệm indole trong hình 7.

        Quá trình giáng hoá indole

          Dương tính cho 1 vòng tròn máu đỏ phía trên môi trường (trái), âm tính là 1 vòng tròn mầu nâu hoặc trong mờ đục (phải).

        Việc xác định các vi sinh vật bằng các thử nghiệm hoá sinh trên đã được thực hiện qua nhiều thế kỷ và đã được tiêu chuẩn hoá. Để các thử nghiệm này được tiến hành thuận lợi hơn, các nhà sản xuất đã chế tạo ra những bộ kit chẩn đoán nhanh để định danh vi khuẩn, ví dụ như strip Api 20.
Các phản ứng sinh hoá trên bộ Api-20



Các thử nghiệm hoá sinh ở đây đã được nghiên cứu và thu nhỏ. Strip Api-20 là một ví dụ về các thử nghiệm loại này, mỗi Strip có 20 test được thực hiện bằng phương thức đơn giản giúp tiết kiệm thời gian và kinh phí. Thử nghiệm đầu tiên giúp nhận biết sự có mặt của enzyme õ-galatosidase, đây là enzym có liên quan tới quá trình dị hoá lactose. Ba phản ứng tiếp theo (theo thứ tự là arginin, lysin and ornithin) là thử nghiệm tách carboxyl của amino acid. Phản ứng decarboxyl được cho thấy bằng 1 phản ứng kiềm (màu đỏ của chất chỉ thị đặc hiệu được sử dụng). Chín thử nghiệm tiếp theo là xác định sự lên men carbohydrat (glucose, mannitol, inositol, sorbitol, rhamnose, sucrose, melibiose, amygdalin và arabinose). Sự lên men được thể hiện bằng 1 phản ứng acid (màu vàng của chất chỉ thị). Sự có mặt của sản phẩm H2S và gelatin hydrolysis (GEL) được thể hiện bằng mầu đen bao phủ khắp ống. Phản ứng dương tính của tryptophan deaminase (TDA) thể hiện bằng màu nâu sẫm khi thêm thuốc thử là FeCl3. Kết quả dương tính của test này giống với phản ứng dương tính của phenylalanin và lysie deaminase, là những phản ứng đặc trưng của Proteus, Morganella and Providencia.

      2.7. Các kỹ thuật phát hiện kháng thể, kháng nguyên và AND của vi khuẩn

        Một trong những hạn chế của các thử nghiệm sinh hoá là vi sinh vật phải phát triển trên một vài môi trường nào đó và thời gian cần ít nhất là 12 - 24 giờ để đọc kết quả. Trên thực tế, các chủng thử nghiệm có thể bị đột biến cho nên không thực hiện được chuyển hoá bình thường như chủng chuẩn khác, ví dụ hầu hết các loài E.coli có khả năng sử dụng lactose như 1 nguồn carbon, tuy nhiên những E.coli phân lập được lại không có khả năng sử dụng lactose. Mặt khác, trong một số trường hợp nuôi cấy phân lập vi khuẩn có thể bị thất bại do việc sử dụng kháng sinh để điều trị. Để khắc phục những nhược điểm này, các kỹ thuật phát hiện kháng nguyên, kháng thể và vật liệu di truyền của vi khuẩn là những công cụ hữư hiệu nhất ngày càng được sử dụng rộng rãi.

      2.7.1. Các kỹ thuật phát hiện kháng nguyên

        - Kỹ thuật ngưng kết hạt (Partical Agglutination).
        - Thử nghiệm kết tủa (Precipilin Tests).
        - Kỹ thuật nhuộm với kháng thể gắn huỳnh quang.
          - Thử nghiệm miễn dịch pha rắn với kháng thể gắn enzym. 

      2.7.2. Các kỹ thuật phát hiện kháng thể

        - Kỹ thuật ngưng kết hạt (Partical Agglutination).
        - Kỹ thuật tủa (Precipitation Assay).
        - Kỹ thuật kết hợp bổ thể (Complêmnt Fixation test).
        - Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym.
        - Kỹ thuật Western Blotting.


          TÀI LIỆU THAM KHẢO

    1.         Lê Huy Chính. Vi sinh Y học. Nhà xuất bản Y học. 2001. 12 - 37, 100 - 119.

    2.         Diagnostic Microbiology. Connie R., Mahon M.S., Giorge Manuselis J.R., W.B Saunder Company.1995.

    3.         Diagnostic Procudures for Bacterial, Mycotic, and parasitic infections, 5th. Bodily. Howard L., Ypdyke, Elaine L, Jame O. American Public Health Association, Inc, New York, 1970.